嗜水气单胞菌分泌型核酸酶介导逃逸团头鲂中性粒细胞胞外网捕杀的机制研究

Aeromonas hydrophila (AH) is an important bacterial pathogen affecting freshwater aquaculture in China, which could cause aquatilia fatal sepsis. Neutrophils are crucial components of the innate immune response during sepsis. However, in the early infection stage, the mechanism of AH in escape from neutrophil killing is still unclear. In our previous study, secretary protein Ahn was found to have DNase activity and was speculated to contribute to AH evasion from neutrophil extracellular traps (NETs) capture and killing. In this project, the role of Ahn in immune evasion will be revealed as follows: (1) Express the Ahn protein and analyze its degradation effect on the NETs of Megalobrama amblycephala. (2) Construct Δahn mutant and complement strain, and demonstrate the AH escape from NETs capture and killing is achieved by Ahn. (3) Establish the infection model of Megalobrama amblycephala and elucidate the immune evasion mechanism mediated by Ahn in vivo. This study lays the foundation for the reveal of the anti-infection effect of Megalobrama amblycephala NETs and pathogenic mechanism of AH, providing an important scientific basis for prevention and control of this bacteria.

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)是我国淡水养殖的重要细菌性病原，感染水生动物以败血症为典型特征。败血症的产生和发展与中性粒细胞密切相关，然而感染早期AH如何逃逸中性粒细胞杀伤的机制尚不清楚。前期工作发现AH的分泌蛋白Ahn具有DNase活性，提示AH通过该蛋白逃逸中性粒细胞胞外网(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)的捕杀作用。本项目拟从蛋白、细胞和活体水平研究Ahn介导的免疫逃逸机制：(1)表达Ahn，研究Ahn对团头鲂NETs的降解作用；(2)构建Δahn缺失菌株和回复菌株，解析Ahn降解NETs的功能和AH逃逸NETs捕杀的机制；(3)建立团头鲂感染模型，在鱼体内阐明Ahn介导的免疫逃逸机制。本研究为揭示团头鲂NETs在抗感染中的作用和深入解析AH的致病机制奠定了基础，为该菌的防控提供了重要科学依据。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是我国淡水养殖的重要细菌性病原，该菌引起的水生动物细菌性败血症，在世界范围内分布广泛，造成持续经济损失，严重阻碍世界水产养殖业健康发展。败血症的产生和发展与病原菌逃逸宿主免疫清除以及在宿主体内成功侵袭扩散密切相关，然而对于嗜水气单胞菌的相关致病机制仍然缺乏了解。.本研究围绕嗜水气单胞菌核酸酶(Aeromonas hydrophila nuclease, Ahn)展开研究，取得了以下研究成果：1）本研究通过同源重组法构建了核酸酶基因ahn缺失株△ahn及其互补菌株C△ahn，生物学特性研究发现△ahn缺失株在体外生长速率、形态以及溶血活性上均与野生株无明显差异。2）为了研究核酸酶在嗜水气单胞菌逃逸宿主免疫清除过程中的作用，首先在体外利用团头鲂头肾吞噬细胞杀伤和小鼠血液杀伤两种模型，发现△ahn缺失株对于吞噬细胞杀伤和小鼠血液杀伤更为敏感；体内实验结果也显示，ahn缺失后，嗜水气单胞菌抗宿主清除能力显著减弱，在团头鲂腹腔以及小鼠皮下air-sac两种模型的竞争感染实验中，△ahn缺失株相较野生株表现出明显的生存劣势。3）建立了嗜水气单胞菌诱导团头鲂头肾吞噬细胞胞外网观察模型，一方面证明核酸酶通过降解吞噬细胞胞外网帮助嗜水气单胞菌逃逸其捕获和杀伤过程；另一方面也证实了团头鲂头肾吞噬细胞能够产生胞外网，并具有杀菌活性。4）通过团头鲂脏器载菌量和小鼠血液载菌量检测，发现△ahn缺失株在宿主体内侵袭扩散能力显著减弱，最后通过团头鲂LD50和小鼠存活实验证明ahn的缺失显著减弱嗜水气单胞菌毒力。综上所述，嗜水气单胞菌核酸酶通过降解吞噬细胞胞外网，介导了该菌逃逸胞外网的捕获和杀伤，在该菌的免疫逃逸、体内侵袭扩散过程中发挥关键作用，是嗜水气单胞菌重要的致病因子。.本项目研究结果为阐明嗜水气单胞菌的分子致病机制奠定理论基础，也为进一步研制针对该菌的新型药物与疫苗提供科学依据；同时本研究结果也丰富了对鱼类天然免疫系统的认识，为其它鱼类天然免疫细胞胞外网的研究提供了借鉴。