忽地笑转运蛋白LaMRP1在加兰他敏转运过程中的功能研究

The alkaloids galanthamine extracted from Amaryllidaceae, has been used clinically for the treatment of Alzheimer disease. The synthesis pathway of galanthamine had been defined, but the research of transport and accumulation mechanism of galanthamine has not been reported yet. One ATP-binding cassette (ABC) transporter LaMRP1 was isolated from the comparative transcriptome analysis in response to MeJA treatment. The pre-experimental results showed that LaMRP1 was probably involved in the galanthamine transport. In this application, the function of LaMRP1 in galanthamine transportation would be charactcterized by using the yeast mutant strain, membrane vesicles and ITC. The change of galanthamine content would be tested after the expression of LaMRP1 was reduced by using the virus induced gene silence (VIGS). Combining the subcellular localization and the expression pattern of LaMRP1, this study would dissect the function of the LaMRP1 in galanthamine transmembrane transport and the long distance transpotation by evidences from three levels the cellular, tissue and the whole plant. This study will enrich the theory of plant alkaloid transport and accumulation mechanism. This application would provide a theoretical basis for genetic engineering to increase the content of galanthamine in Lycoris aurea.

石蒜科植物特有的生物碱加兰他敏在临床上被广泛用于治疗阿尔茨海默病。加兰他敏生物合成途径已基本明确，但其转运模式仍有待阐释。前期，申请人在石蒜属植物忽地笑差异转录组数据中，发掘到一个ABC类转运蛋白LaMRP1，初步研究结果表明该蛋白极有可能参与加兰他敏的转运。为了探讨LaMRP1在加兰他敏跨膜转运中的作用，本申请拟通过酵母突变体功能互补、膜微囊和ITC等技术手段，进一步明确LaMRP1对加兰他敏的转运特征（转运方向、底物专一性和结合系数）；利用病毒介导的基因沉默（VIGS）技术抑制LaMRP1表达，检测植株各组织加兰他敏含量的变化，并结合LaMRP1的亚细胞定位和组织定位，从细胞、组织和植株三个层面揭示LaMRP1在加兰他敏转运过程中的作用，探讨加兰他敏在忽地笑体内运输的分子机制。研究结果将丰富生物碱在植物体内运输的分子机理研究，也为培育高加兰他敏含量的忽地笑品种提供一定的理论指导。

石蒜科植物特有的生物碱加兰他敏在临床上被广泛用于治疗阿尔茨海默病。加兰他敏生物合成途径已基本明确，但其转运模式仍有待阐释。前期，申请人在石蒜属植物忽地笑差异转录组数据中，发掘到对茉莉酸甲酯处理响应的ABC类转运蛋白LaABCG3，LaABCG5以及LaABCB11。本研究从分子、细胞和组织等几个层面先后对这三个转运蛋白的功能进行分析和验证。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了三个转运蛋白的全长基因，结果表明LaABCG3和LaABCG5属于典型的ABCG家族蛋白，且具有的组织特异性表达特征，其表达组织与加兰他敏的积累部位有较好的吻合。在MeJA处理下，LaABCG3和LaABCG5的表达量和加兰他敏的含量均受到显著诱导，说明LaABCG3和LaABCG5有可能参与加兰他敏的转运。通过酵母突变体功能互补实验证实，在酵母细胞异源表达体系中，转运蛋白LaABCB11对石蒜碱有内向跨膜转运的功能。并且该蛋白对加兰他敏没有转运功能说明其有较好的底物专一性。通过组织原位杂交实验，本研究将LaABCB11的表达组织定位于叶片与鳞茎的维管束，以及根部组织的皮层细胞，该结果说明LaABCB11有可能参与了石蒜碱的长距离运输，以及在根部细胞中积累的跨膜转运过程。另外，本研究也涉及了microRNA对加兰他敏合成路径中关键酶LaTYDC1的调控。本实验克隆了LaTYDC1基因全长，在体外验证了LaTYDC1的酶活性，发现LaTYDC1不仅能够催化酪氨酸脱羧产生酪胺还可以催化多巴产生多巴胺，通过RLM-RACE实验找到了miR396对LaTYDC1的靶向切割位点，并分析表达谱发现miR396与LaTYDC1的表达呈负相关，以上证据表明miR196通过对LaTYDC1表达量的调控，参与了调控加兰他敏合成的信号途径。本研究结果将丰富生物碱在植物体内运输的分子机理研究，也为培育高加兰他敏含量的忽地笑品种提供一定的理论指导。