Pax1抑制宫颈癌发生侵袭的机制及其甲基化的临床评价

Inactivation of tumor suppressor genes (TSGs) through promoter hypermethylation has been reported as an early and important event in cancer. Currently, although some epigenetic drugs have been proven that can induce re-expression of a variety of hypermethylated silenced genes. However, the disadvantages of these drugs include their lack of gene-target specificity. Previously research shown that Pax1 gene promoter hypermethylation can be considered to be as an early diagnosis markers of cervical cancer, it is has been proved in our group as well. Meanwhile, Pax1 hypermethylation has also been reported in head and neck cancer, oral cancer, ovarian cancer etc. Additionally, it is proved that Pax1 gene mutation induces vertebral column disfunction. However, the role of Pax1 in cervical cancer hasnot been investigated so far. Therefore, in this study, firstly, we will explore a Pax1 promoter-specific Artificial Transcription Factors (ATF) to disclose that DNA methylation could regulate the expression of Pax1. Subsequencely, we will demonstrate the hypothesis that ectopic expression of Pax1 suppresses cell growth and invasion in vitro and tumorigenicity in vivo. Based on the functional analysis, we will further explore the relationship between Pax1 and Wnt pathway. Finally, the relationship between Pax1 hypermethylation and clinical characteristics of cervical cancer will evaluated in a large cohort. This project will provide a strong theoretical and experimental foundation for further elucidation the pathogenesis of cervical cancer，and future clinical screening and targeted- drug development as well.

甲基化修饰导致抑癌基因的失活是肿瘤发生的早期事件和重要机制之一。目前，临床去甲基化药物应用的主要副作用是因缺乏特异的基因作用靶点而引起整体正常基因的去甲基化。已有研究及本项目的前期筛选验证均显示转录因子Pax1的基因甲基化有望成为宫颈癌的早期诊断标志物。此外，Pax1的甲基化还与头颈癌，口腔癌，卵巢癌，乳腺癌等多种肿瘤相关，其基因缺陷亦会导致脊柱缺陷。然而，目前对其致病的分子机制研究尚不足。因此，本课题将采用体外和体内实验首次印证Pax1抑制宫颈癌的发生侵袭，且与Wnt信号通路相关；采用自行设计的人工转录因子深入研究DNA甲基化修饰对Pax1转录调控的有效作用位点；同时，更广泛探讨Pax1基因启动子甲基化与宫颈癌临床病理特征的相关性，评价其临床应用价值。该课题的实施将为阐明宫颈癌的发生机制，建立临床筛查策略，表观靶向药物的研发、甲基化基因功能的诠释奠定坚实理论和实验基础，具有重要科学意义。

宫颈癌是女性的常见癌症之一，在发达国家位居女性癌症的第四位，而在发展中国家居于女性癌症的第二位，且近年来，年轻女性的宫颈癌发病率，死亡率均呈上升趋势。虽然，己有明确的证据支持高危人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌发生密切相关, 但宫颈癌的发生是一多因素、多步骤、多阶段的过程。HPV感染并不是宫颈癌发生的一个充分原因，只有小部分受HPV感染的妇女最终发展成为宫颈癌。所以，在宫颈癌的自然形成过程中尚需要其他因素的参与。. 近来研究证实表观遗传学的调控与宫颈癌的发生密切相关。其中，DNA甲基化是表观遗传学修饰的最重要调控方式之一, 某些抑癌基因的启动子区发生甲基化修饰，可降低其转录活性，使基因表达沉默，导致细胞增殖异常而产生恶性肿瘤。这些基因启动子区异常甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，是肿瘤早期诊断非常有效的分子标志。此外，该甲基化修饰的过程是一个可逆的过程。而既往的临床研究证实应用去甲基化药物治疗的主要副作用是因缺乏特异的基因作用靶点。最近，第三代基因编辑技术——CRISPR/ Cas9技术的诞生为该研究开辟了道路，其衍生的CRISPR/dCas9 系统去除了Cas9蛋白的“剪刀”功能，可以和靶位点结合，但不对 DNA 进行切割，同时可以将附加的激活子、抑制子或者加甲基、去甲基等修饰酶带到靶基因，从而实现对靶基因的精准调控。. 因此，本项目首先在中国大陆妇女群体围绕PAX1及宫颈癌相关的甲基化基因进行了的临床细胞学样本的测评，证实了其作为宫颈癌筛查的标志物的可行性；同时，更重要的是成功构建和验证了针对PAX1基因的甲基化干扰调控的CRISPR系统，为后续的甲基化基因功能的诠释提供了直接的证据，为靶向治疗奠定了基础。此外，本项目新鉴定了一个与宫颈癌发生密切相关的甲基化基因EphA7，并对该基因开展了临床评价和机制研究。通过本课题的实施对阐明宫颈癌的发生机制，靶向药物的研发具有重要的科学意义。