HPG轴调控草鱼肠道PepT1及LAT的研究

The project is focus on key factors of protein absorption during breeding seasons. The preliminary work of applicant showed that PepT1 was up-regulated by hCG injection. The project will carry out the study in following fields: 1) Using various methods of molecular biology, we will study the expression pattern of peptide transporter and L- amino acid transporter in grass carp intestine during the whole reproductive cycle; 2) Through peritoneal injection and primary cell culture of intestine, we will elucidate the mechanism of peptides and L-amino acids transporters regulated by hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis which is the key regulatory axis of reproductive; 3) By employing antagonists of HPG aixs factors, we will intervene in the expression of hormones to explore a new way of artificial regulation of peptides and L-amino acids transporters through drugs. The present study will focus on functional expression pattern of the reproductive cycle, HPG regulation and artificial intervention which will build a bridge between reproductive and protein nutrition regulation. It would provide a physiology basis on regulation of reproductive nutrition and offer a new approach for altering reproductive performance of maternal fish.

本项目针对繁殖季节蛋白吸收的关键因子进行研究，着力研究草鱼肠道小肽和L-氨基酸转运载体在繁殖期的变化规律及调控机制。申请者前期的研究工作表明，通过注射hCG能够促进草鱼肠道中的小肽转运载体PepT1表达。本项目拟从以下几个方面开展研究：1）运用多种分子生物学手段，研究整个生殖周期内，草鱼肠道小肽和L-氨基酸转运载体相关基因的表达规律；2）通过腹腔注射和肠道原代细胞培养，阐明下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，这一控制生殖活动的关键调控轴对小肽和L-氨基酸转运载体的调节机制；3）采用多种HPG轴相关因子的拮抗剂，干预相关激素表达，探索通过外源药物人为调节小肽和L-氨基酸转运载体表达的新方法。从生殖周期的功能性表达规律、HPG轴的调节机制和人为干预其表达三个方面，构建生殖调控和蛋白营养调控间的桥梁，为进一步研究繁殖营养调控奠定重要的生理学基础，为提高亲鱼的繁殖性能开辟新的途径。

小肽转运载体和氨基酸转运载体是蛋白质在肠道中消化吸收中的关键因子。为探讨小肽转运和氨基酸转运在草鱼生殖周期的功能性表达以及其关键调控机理，本项目从生殖周期功能性表达、HPG轴关键调控机制以及人为干预表达三个层次，构建了生殖调控轴和蛋白营养调控间的桥梁。我们通过收集1、3、5龄草鱼的肠道组织，进行了PepT1、SP1、CDX2、LAT2的表达变化研究，发现PepT1及调控因子的表达在成熟期的草鱼中明显升高。LAT2在雄性草鱼肠道中，也在5龄性成熟期表达量最高。分别对草鱼注射0.05 μg/g的LHRH-A和0.3mg/kg的E2，以研究HPG轴对小肽转运载体和氨基酸转运载体的表达调控作用。其中，LHRH-A能够显著提升肠道中PepT、SP1、CDX2、LAT2的mRNA表达。E2则能够刺激PepT、SP1、CDX2的mRNA表达，而仅仅LAT2在注射E2未发现有表达变化。对不同组织的ER受体表达分析表明，ERα、ERβ1 和ERβ2为广泛性表达基因，且在肠道中有丰富的表达。因此，HPG轴通过级联反应，刺激性腺分泌E2，性腺中E2 通过血液循环进入肠道，与肠道上的ER结合，促进肠道PepT1 基因的表达。人为干预HPG轴，调节鱼类生理活动，已经是较为成熟的技术手段。在了解HPG轴对小肽转运载体和氨基酸转运载体的调节作用后，对1龄草鱼注射5 mg/kg ER拮抗剂ICI182780，结果发现注射组的PepT1和LAT2基因表达出现明显下降。因此，人为调节HPG轴可以达到调控小肽转运载体和氨基酸转运载体表达的目的。