草鱼肠道PepT1对小肽的偏好性转运及机制研究

Peptide nutrition is a vital and indispensable part of protein nutrition, also becoming the new hot spot of feed industry. Oligopeptide transporter protein PepT1(Oligopeptide transporter 1) plays a significant role in peptide nutrition absorption of animal. We preliminarily confirmed the existence of preference transportation for intestinal PepT1 to oligopeptides in grass carp in our previous work. Based upon that, this project intends to study the influence of both the structures of PepT1 protein and oligopeptides to translocation efficiency of oligopeptides to ascertain the preference transportation of intestinal PepT1 to oligopeptides; Additionally, preferely transported oligopeptides mediating the regulation of upstream gene to PepT1 would be analyzed to elucidate the upstream regulation mechanism of the preference transportation of PepT1 to oligopeptides. Furthermore, the varieties of the oligopeptide translocation efficiency and interaction of PepT1 with oligopeptides were determined to reveal the molecular mechanism related to PepT1 structure for oligopeptide preference transportation in grass carp by mutations of the key binding site of PepT1 to oligopeptides. This project would uncover a new field and perspective to oligopeptide transportation of intestinal PepT1 in grass carp, enrich the theories foundation of oligopeptide absorption in fish intestine and high efficient utilization of feed, as well as provide new research route or methods to the optimization of fish feed formulation and the research and development of peptide drug.

小肽营养是蛋白质营养的重要组成部分，是饲料行业新的研究热点。小肽转运蛋白PepT1（Oligopeptide transporter 1）在动物小肽营养吸收方面扮演非常重要的角色。前期，我们确认草鱼肠道PepT1对小肽的转运存在偏好性。基于此研究基础，本项目拟进一步研究草鱼肠道PepT1蛋白和小肽结构对小肽转运效率的影响，明确PepT1对小肽的偏好性转运；分析偏好性转运小肽介导上游调控基因对PepT1的调控作用，阐明PepT1对小肽偏好性转运的上游调控机制;通过对PepT1蛋白上小肽关键结合位点的定点突变，研究小肽转运效率及PepT1与小肽相互作用的变化，揭示PepT1对小肽偏好性转运基于结构的分子机制。本项目将为草鱼PepT1的小肽转运研究开启一个新的领域和视角，丰富鱼类肠道小肽吸收及饲料蛋白高效利用的理论基础，并为鱼类饲料配方优化及肽类药物研究与发展提供新的研究思路或方法。

小肽营养是蛋白质营养的重要组成部分，是饲料行业新的研究热点。小肽转运蛋白PepT1在动物小肽营养吸收方面扮演非常重要的角色。小肽转运蛋白PepT1能转运多种小肽，但为适应生物体对一些重要或特殊氨基酸的需要，其在转运上具有一定的偏好性。偏好性小肽的筛选对蛋白质的高效吸收及动物饲料配方的优化与开发，动物肽类药物的研究与发展具有精准的指导意义。目前PepT1转运小肽的偏好性知之甚少，具体分子机制也还不是很清楚，尤其是在研究较少的低等动物鱼类。本项目采用同源建模获得了草鱼肠道PepT1的蛋白3D结构，通过MOE对接分析了草鱼PepT1与55种不同小肽的结合能量，发现草鱼PepT1对三肽的结合偏好性明显高于大部分的二肽，Lys在N端对草鱼 PepT1的亲和力明显高于其处于C等，初步揭示了草鱼肠道PepT1转运小肽的偏好性。在HEK293T中通过宽场成像仪扫描分析发现不同偏好性小肽对HEK293T细胞中PepT1荧光表达影响不同；在酵母细胞中验证了草鱼肠道PepT1对小肽功能缺失酵母的小肽转运功能的恢复并分析了不同小肽对酵母生长的影响，阐明草鱼肠道PepT1的小肽转运功能及不同偏好性小肽对PepT1表达及生长的影响；验证了上游转录因子CDX2与PepT1的相互作用；为进一步分了析CDX2对PepT1的调控作用，本项目分析了CDX2的磷酸泛素化降解机制，并发现在离体和在体条件下降低CDX2 mRNA及蛋白表达水平会降低PepT1的表达，以及小肽AAA对CDX2及PepT1表达的促进左右，阐明了CDX2在细胞内的稳定性机制及其参与调控草鱼PepT1表达及小肽转运的分子机制；明确了CDX2/SP1介导TB对PepT1表达的调控，从而揭示草鱼肠道PepT1的上游调控因子及营养干预机制。通过养殖实验分析，不同偏好性小肽对草鱼生长、免疫及肌肉品质等方面的不同影响，揭示草鱼PepT1偏好性转运小肽的功能。本项目从分子水平上揭示了草鱼PepT1对小肽的偏好性转运、偏好性转运小肽的功能及调控分子机制，丰富了鱼类肠道小肽吸收及饲料蛋白高效利用的理论基础，并为鱼类饲料配方优化及肽类药物的研究与发展提供了新的研究思路或方法。