低氧调节的TNFR1-PLAD和LIF双重抑制种植体周围炎性骨吸收的研究

De-osseointegration induced by inflammatory bone resorption is the priciple tissue reaction of peri-implantitis and the main reason of implant loss. The current research showed that the non-specific "excessive inflammation" led by the host immunological defence plays a key role in the development and enlargement of the bone resorption. Osteoclast is the central functional cell for bone resorption. Hence, the inhibition of both excessive inflammation and osteoclast are reasonable, for the sake of not only the reduction of the excessive inflammation, but also the blocking of upstream and terminal signalling of osteoclast formation. This project aims to: use the soluble tumor necrosis factor alpha receptor I pre-ligand assembly domain (TNFR1-PLAD) to specifically block sTNF-αand RANKL cell signaling, via attenuation of inflammation; on the other hand to use leukemia inhibitory factor (LIF) overexpression to inhibit the mature of osteoclast. We plan to construct the TNFR1-PLAD and LIF overexpression plasmid with a hypoxia response element in upstream of the promoter, so that the gene expression can be activated only in hypoxia inflammatory microenvironment.

炎性骨吸收导致的骨结合破坏是种植体周围炎最主要的病理损伤，也是导致种植体脱落的直接原因。最新研究证实：宿主防御牙周致病菌所引发的非特异性"过度炎性"反应，在骨吸收扩大和持续中起重要作用。同时破骨细胞是参与骨吸收的主要功能细胞。因此，合理抑制过度炎性反应和直接抑制破骨细胞形成，不仅可以在不影响宿主特异性免疫应答基础上减轻炎性反应，而且能分别从"炎性-破骨"信号的上游和终端阻断破骨效应。本课题一方面，利用肿瘤坏死因子α受体1的胞外段序列（TNFR1-PLAD）特异性阻断可溶性TNF-α，从抑制过度炎性反应的角度，抑制RANKL炎性破骨信号；另一方面，通过白血病抑制因子（LIF）的过表达，从直接抑制破骨细胞形成的角度，对抗种植体周围炎性骨吸收。本课题拟设计低氧调节型过表达质粒载体，使TNFR1-PLAD和LIF靶向表达于种植体周围炎性微环境，双重抑制炎性骨吸收。

一 发现TNFR1-PLAD可以抑制炎症状况下NF-KB通路的激活.1、TNFR1-PLAD慢病毒转染人原代牙龈成纤维细胞（human-HGF)，成功检测到在HGF细胞中的PLAD过表达产物。结果显示，在TNF-a刺激下，PLAD过表达组细胞内NF-KB通路的激活受到抑制。提示体外条件下，细胞内过表达PLAD可以抑制TNF-a相关炎症通路，为体内实验提供基础依据。 .2 GST-PLAD重组蛋白的体外表达和纯化. 通过大肠杆菌表达系统，体外表达GST-PLAD重组蛋白并纯化。western检测GST-PLAD重组蛋白。.二 发现LIF对种植周骨髓间充质干细胞（BMSC）具有抑制凋亡的保护作用.本研究首次发现LIF对体外缺血模型下的骨髓间充质干细胞具有抑制凋亡的保护作用，参与了对细胞线粒体凋亡途径的调节。有别于经典的JAK2/STAT3信号通路，本研究发现，在大鼠骨髓间充质干细胞中，LIF主要通过激活JAK1/STAT3信号通路来发挥抑制细胞凋亡的作用。.三 建立新的种植体周围炎给药动物模型及其体内外实验. 1 缓释基台和种植体的设计与加工. 缓释基台的设计获得国家实用新型专利授权（专利号ZL 201220261387.2），证书见图7。. 2 体外实验：载药基台抑菌效果检测. 以盐酸米洛环素软膏为实验药物，进行载药基台对口腔常见细菌变形链球菌、菌斑形成早期聚集菌血链球菌、种植体周围炎重要致病菌牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌效 果的检测，结果显示加载实验药物后，三种尺寸孔径的载药基台对上述菌均有抑制作用。. 3体内实验：载药基台抑制菌斑形成效果检测和对种植体周围炎的作用.体内载药基台对于种植体植入后早期基台表面菌斑附着的影响研究，结果显示，实验组早期菌斑附着量较对照组明显减少。以丝线结扎法建立狗种植体周围炎症模型，进行临床和放射学检查，载有米洛环素的载药基台组种植体周围组织健康状况明显好于另外两组。菌斑染色结果显示，载有米洛环素的载药基台菌斑附着明显少于其他两组。同时，在种植体周围炎症进行期，载有米洛环素的载药基台组种植体周围炎症发展相对得到缓解。.四 完成LIF基因敲除小鼠模型建立.从EMMA(the European Mouse Mutant Archive)购回Liftm1Stw/Cnbc LIF基因敲除小鼠。目前已获得纯合基因敲除小鼠。