中心体蛋白SAS-4/CPAP及其复合物的结构与功能研究

Centrosomes are macromolecular structures, which is composed of a pair of centrioles surrounded by a multi-protein complexes network of Peri-Centriole Material (PCM) nucleating and organizing microtubules in cytoplasm. In order for centrosomes to form functional organelles as the MTOCs in cells, it must first assemble a centriole and successfully recruit PCM around it. PCM recruitment begins with forming PCM protein complexes in cytoplasm, which are then targeted to centrioles. In this process, SAS-4/CPAP, a conserved centrosomal protein that is essential for centriole formation, scaffolds cytoplasmic PCM protein complexes (SAS-4-PCM complexes) via its N-terminal domain and tethers the components of SAS-4-PCM complexes to the centriole via its conserved C-terminal TCP domain. In this process, tubulin dimer present within the SAS-4-PCM complex (SAS-4-tubulin module) negatively regulates the PCM complexes assembling ability of SAS-4. The TCP domain of SAS-4 then mediates the tethering of the pre-assembled SAS-4-PCM complexes to a centriole by interacting with centriole protein ANA2/STIL and Bld10/Cep135. Although the role of SAS-4 in centrosome biogenesis is critical, little is known about their structures, molecular mechanisms and functions. Therefore, in this proposal, we are asking a fundamental question in cell biology: how SAS-4 involving protein complexes assemble and then coordinate PCM proteins recruitment and anchoring in generating functional centrosomes? To address this question, we propose to solve the crystal structures of SAS-4 and its complexes (SAS-4-tubulin, SAS-4-ANA2 and SAS-4-Bld10), and in combination with biochemistry, cell biology and genetics tools to obtain mechanistic insights into SAS-4/CPAP-mediated functional centrosome biogenesis. This work shall pave the way for SAS-4/CPAP-targeted small molecules screening and optimization.

中心体由一对中心粒和中心粒周质（PCM）组成,中心粒必须成功招募PCM蛋白，才能使中心体发育成功能性细胞器。在PCM招募过程中，SAS-4/CPAP起到关键作用。一方面SAS-4/CPAP通过其N端与alpha/beta-tubulin结合并招募形成PCM复合物，另一方面通过其C端TCP结构域与中心粒蛋白ANA2和Bld10相互作用，将PCM复合物定向转运并锚定在中心粒周围。目前SAS-4/CPAP如何形成超级复合物并协调PCM复合物的定向锚定尚缺少结构信息。我们计划以蛋白质晶体学为主要研究手段，结合生物化学细胞生物学和果蝇遗传学等技术，开展SAS-4/CPAP蛋白自身，及其与alpha/beta-tubulin、ANA2/STIL、Bld10/Cep135等蛋白复合物的结构与功能研究，以期在分子水平上揭示SAS-4/CPAP介导PCM复合物形成及锚定机制，并为相关药物设计工作提供基础。

中心体是细胞内一类极其重要的细胞器，由一对中心粒和包绕其外的中心粒周质组成。由于中心粒周质是细胞质中微管成核和锚定的主要场所，中心体被称为动物细胞中的主要微管组织中心。中心体在一个细胞周期中只完成一次复制，研究表明，有大量蛋白参与此过程。中心粒完成复制后，必须招募中心粒周质蛋白至中心粒周围，才能使中心体具备正常的生物功能。中心体蛋白Sas-4/CPAP参与中心粒的复制和组装主要有两方面的功能，一方面，Sas-4/CPAP可以通过N端结构域在胞质中招募形成包含Sas-4的中心粒周质蛋白复合物；并通过其C端TCP结构域将N端招募的中心粒周质蛋白复合物锚定在中心粒上。另一方面，Sas-4/CPAP蛋白N端PN2-3结构域以高亲和力结合一分子alpha/beta-Tubulin，并且具有微管解聚活力；而延长的PN2-3结构域则没有微管解聚活力，相反则具有微管组装活力，可以在体外和体内促进细胞内微管的自发组装，暗示PN2-3结构域可能在中心粒微管组装和延伸，特别是Tubulin截获、Tubulin转运以及Tubulin组装中发挥重要功能。我们主要采取X-射线蛋白质晶体学的方法，解析了人CPAP蛋白PN2-3-Tubulin复合物的2.1Å晶体结构，并综合利用等温量热滴定、投射电镜、细胞生物学和全内反射荧光显微镜等技术手段，探明了Sas-4/CPAP蛋白参与中心粒微管组装并调控中心粒微管长度的重要作用，为全面研究Sas-4/CPAP蛋白在中心体复制和组装过程中发挥的生物功能奠定了重要基础。