利用TMP蛋白调控系统和CRISPR基因编辑技术制作快速可逆诱导型肝损伤猪模型

Hereditary tyrosinemia type 1 (HT1) is very valuable for the study of liver injury and liver regeneration, it is caused by the loss of expression of FAH hydrolase. At present, there are several animal model mimic HT1 disease: FAH gene knockout(KO) mice, rats and pigs. But they all have deficiencies, like: incomplete symptoms, needing longer production cycle to make double gene KO animals, providing large amount of NTBC to maintain animal birth and survival. In addition, we had made FAH KO rabbits before, and the mortality was indeed high. To solve these problems, we intend to insert the DD-degrading protein sequence which can be induced by TMP into the downstream of the porcine FAH gene, making them fused-expression, and thus the degradation and stable expression of fah hydrolase can be reversible induced by TMP, and in this way the phenotype of liver injury can be tunable and reversible. We can modulate the time and dose of TMP given to cloned pigs to regulate the degree of liver injury, so that they can better mimic the clinical manifestations, including all the symptoms of acute and chronic liver injury, like liver fibrosis, liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma. This disease model will become the best acute, chronic liver disease and liver regeneration research animal model.

高酪氨酸血症（HT1）是一种研究肝损伤、肝再生极有价值的疾病，FAH水解酶表达缺失是该病的主要致病因。目前已有FAH基因敲除小鼠、大鼠和猪等疾病模型，但它们都存在一些不足：表症不全；双等位基因敲除动物制作周期长；需大量供给NTBC药物才能维持动物出生及存活。此外，本研究团队之前也制作过FAH基因敲除兔，其死亡率确实较高。为解决以上问题，我们将可依赖TMP诱导的DD降解蛋白序列敲入至猪FAH基因下游，使得二者融合表达，由TMP可逆诱导FAH水解酶的降解和稳定表达，从而可逆的调控动物肝损伤的表型。我们可根据该蛋白调控系统的时间和剂量依赖性，精准调控肝损伤程度，使克隆猪出现更接近临床的表症，包括急性和慢性肝损伤的全部症状，如肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌等，成为最佳急性、慢性肝病及肝再生研究动物模型。

目前，全球每年患有肝损伤甚至肝衰竭病人众多，新的治疗方法，包括干细胞移植治疗，新型生物人工肝，基因治疗等层出不穷，因此，亟需忠实可靠的动物模型用于治疗评估。大动物猪以其器官大小及生理功能与人相似的特点逐渐成为极为重要的生物医学动物模型，可逆诱导蛋白表达调控系统也凭借精准可操控优势成为基因修饰，蛋白表达调控不可或缺的重要技术。在本研究中，我们构建了DD-EGFP KI系统，利用293t细胞系体外检测了DD系统在小分子TMP诱导下蛋白表达的有效性；同时我们还针对其灵敏性不足的缺陷，优化设计构建了“Tet-3G-SMASh”双向快速诱导蛋白表达调控系统，该系统在DOX诱导下快速启动蛋白表达，在ASV诱导下快速降解蛋白，并对药物作用时间及浓度表现出高灵敏性。此外，我们还研发了更加高效的基因定点敲入PFF克隆制作方法，与传统的HDR介导的基因敲入方法相比，NHEJ介导的基因敲入技术载体设计更加简洁，转染效率更高同时KI克隆也更多。最后我们还高效制作了双人源化蛋白克隆猪——人凝血因子7及白蛋白基因定点敲入克隆猪，阳性克隆猪已用于生物人工肝感应器治疗急性肝衰猴模型上，为新型生物人工肝的研发更进一步，同时该克隆猪的制作也为其他更多人源化蛋白克隆猪，人肝嵌合猪制作奠定基础及提供新思路。