基于精原干细胞移植技术制作基因编辑猪

Spermatogonial stem cells (SSCs) maintain spermatogenesis and sustain male fertility by undergoing self-renewal and differentiation to produce sperm continuously. SSCs are valuable tools in study on spermatogenesis and male fertility, generation of genetically modified animals and reproduction of farm animals with traits of economic importance. SSCs transplantation provides a simple and less-costly manner to reproduce farm animals. However, there is no report of production of SSCs-derived pigs following SSCs transplantation to date. In this proposal we will establish genetically modified pigs by combining genetic engineering technology with SSCs transplantation. This study includes the following steps: 1. Isolation and in-vitro culture of porcine SSCs. 2. Obtaining knock-out and knock-in SSCs via CRISPR/Cpf1-mediated genome editing to target loci. 3. Busulfan treatment to deplete the endogenous germ cells of recipient pigs. SSCs transplantation to restore the spermatogenesis of recipients. Production of live offspring harboring the targeted mutation by mating the transplanted recipients with female pigs. This study will pave the way for establishing the genetically modified pigs in a simple and economical approach. Furthermore, the strategy can be extended to other farm animals, especially those animals lack of mature embryo manipulation techniques, in generation of genetically modified animal models for agricultural and biomedical applications.

精原干细胞是雄性生殖干细胞，其既能在动物整个生命期间进行自我更新，也能在体内定向分化为各阶段的生精细胞直至精子，向下一代传递遗传信息。基于精原干细胞的家畜制作方法是当前亟待建立的技术平台，是一条便捷、经济地繁育家畜品种、制作基因修饰动物的有效途径。迄今还没有以精原干细胞移植制备猪的报道。本项目拟采用精原干细胞体外培养与移植技术，以及CRISPR介导的基因编辑技术来建立基因编辑猪。研究包括：1. 猪精原干细胞的分离和体外培养。2. 以CRISPR/Cpf1系统对精原干细胞的靶基因进行基因敲除和基因敲入操作，分别获得基因敲除和基因敲入的精原干细胞。3. 药物处理去除受体猪内源精原干细胞，再移植基因编辑的精原干细胞，恢复受体生精能力，经配种出生基因编辑猪后代。该研究途径无需胚胎操作，可以便捷、低成本地制作基因编辑猪，同时也为其它动物，尤其是胚胎操作技术不成熟的动物的基因操作提供重要的技术途径。

本项目研究猪的精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）分离、培养、移植的技术流程，并对猪SSCs进行基因编辑进行探讨，建立一种不依赖于胚胎操作、可便捷地应用于养殖场的种猪繁殖技术及猪基因修饰技术。虽然小鼠等啮齿类动物的SSC长期培养和移植技术流程已经建立，但是猪的SSC长期培养及移植依然存在诸多难题。在本研究中，我们采用两步酶裂解法和差速贴壁法纯化猪SSCs，并在基础培养液中添加4种生长因子实现猪的SSCs在体外不依赖于饲养层细胞的培养，培养的SSC纯度大于50%，可持续增殖至少1个月。我们采用慢病毒包装的CRISPR系统对SSC进行转导，探讨对SSC进行基因编辑的可能性。在APN位点，我们可实现基因敲除效率20以上，同时我们也可以实现对H11位点进行基因敲入操作。我们采用白消安药物局部注射消除猪的内源SSC，建立可供移植的受体，虽然短期内白消安处理可以较大范围地消除内源SSC并保持睾丸结构和支持细胞的完整，但是外源SSC移植后定植和精子发生依然低下，并且长期跟踪可发现大量的内源SSC再生，因此白消安处理并不能完全消除内源SSC进而提供理想的受体用于SSC移植。为了解决SSC移植这一难题，我们建立了基因修饰的内源精子发生完全缺失的受体动物模型，我们先从小鼠模型上证实了这一技术的可行性。我们建立了ETV5基因敲除小鼠，小鼠内源SSC发生进行性的缺失导致雄性不育，同时睾丸结构和其他支持细胞都保持完整，提供了外源SSC移植的良好微环境。以ETV5敲除小鼠作为受体进行同种异体SSC移植实现了SSC的有效再生并产生供体来源的精子，证实了基因修饰代精公畜的可行型。基于小鼠模型的结果，我们制备了ETV5和Pramef12两种基因敲除的代精公猪模型，其中ETV5基因敲除猪并没有表现出SSC和精子发生的缺陷，说明大动物和小动物基因功能的差异；Pramef12基因敲除猪目前还达到性成熟阶段。本研究建立了稳定的猪SSC体外培养技术方案，探讨了猪SSC基因编辑的可行性，并建立了一种新型的基因修饰代精公猪技术方案，为进一步实现猪SSC有效移植打下了基础。