影响葡萄CRISPR／Cas9系统编辑效率的因素探究、以及特异型和诱导型基因编辑系统的建立与应用

Grape is one of the most important fruit in the worldwide. The good cultivars are the basement of grape industry development. The traditional breeding methods are time consuming，much labor，low efficiency due to its perennial plant, and the new technologies are necessary in grape breeding in the future. The CRISPR/Cas9 system is efficient gene editing technology. But there are still many problems which need be resolved. These questions restrain the application of CRISPR/Cas9，such as the relationship between the efficiency of gene knockout and the expression of sgRNA/Cas9, target-off, and homo-phenotypes, and the differences among genotypes. In this proposal, based on the confirmed CRISPR/Cas9 system in grape in our lab, we study the efficiency and difference of CRISPR/Cas9 among genotypes including wild species, hybrids between Vitis labrusca and V. vitis, V. vinifera; looking for the factors which determine the genes and phenotypes knockout efficiency; construct specific CRISPR expressed vectors with RNA-seq；build induced CRISPR/Cas9 systems through transforming the Cas9 protein and vectors。The proposal will not only promote theoretical research of CRISPR/Cas9 system， but also improve the functional genomics in grape, and provide the theoretical and technological supports in grape breeding in the future.

葡萄是最重要的果树之一，多年生植物，传统育种耗时费力，效率低下，采用新技术育种是未来葡品种选育的发展方向。CRISPR/Cas9系统是有效的基因编辑技术，但是仍存在很多问题，如基因敲除效率与sgRNA/Cas9表达量的具体关系，脱靶效应以及产生纯合表型的影响因素、不同基因型编辑效率的差异等，这些问题都制约着CRISPR技术的应用。本项目是在实验室已验证CRISPR/Cas9系统在葡萄中有效性的基础上，研究包括野生种、欧美杂交种、欧亚种等不同品种中CRISPR系统的有效性以及差异；分析影响基因敲除效率和敲除表型的因素；利用转录组分析技术，构建特异型的CRISPR表达载体；通过对原载体中的Cas蛋白启动子以及CRISPR载体进行改造，建立诱导型CRISPR/Cas9系统。本项目的实施不仅能促进CRISPR/Cas9系统理论研究，有助于葡萄基因功能研究，同时为未来葡萄品种选育提供理论和技术支撑。

葡萄是重要的多年生果树作物，以CRISPR/Cas9系统为代表的基因编辑技术是葡萄分子育种的重要手段。虽然CRISPR/Cas9系统在葡萄基因编辑中的有效性已经得到了证实，然而影响葡萄基因编辑效率的因素，如sgRNA/Cas9的表达量与编辑效率的关系、不同葡萄基因型编辑效率的差异等都还未研究。本项目在实验室前期建立的CRISPR/Cas9系统基础上，系统性研究了靶位点GC含量、sgRNA/Cas9表达量、以及不同葡萄品种（基因型）对编辑效率的影响，提出了高GC含量、高sgRNA/Cas9表达量能明显提升葡萄基因编辑效率的观点；此外，利用转录组数据分析基因表达情况，筛选到了100个葡萄组织特异表达的基因，并成功克隆了5个特异表达基因的启动子，为特异型CRISPR/Cas9系统的构建奠定了基础；利用雌二醇诱导表达的XVE系统，将Cas9基因的表达置于XVE系统控制之下，构建了诱导型的CRISPR/Cas9系统，并在烟草中进行了有效性的验证，为葡萄中的应用提供了参考；基于上述研究结果，我们开发了葡萄以及其他植物基因编辑的设计工具Plant-CRISPR，为开展更为有效的基因编辑提供了有力的技术支持。总之，通过本项目的研究，揭示了靶位点序列、sgRNA/Cas9表达量，不同基因型等因素对CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率的影响，为提高葡萄基因编辑效率提供了理论依据，同时鉴定并筛选了一批葡萄组织特异表达的候选基因，并克隆了一些葡萄组织特异型的启动子，另外还建立了基于XVE系统的诱导型CRISPR/Cas9系统，为开展组织特异和可诱导的基因编辑提供了技术平台，将有助于葡萄基因功能研究，并加快葡萄分子育种进程。