基于p62调控细胞内死亡诱导复合体探讨自噬与凋亡参与卵巢癌耐药机制的研究

Cisplatin resistance is still the obstacle of ovarian cancer clinic treatment. It remains a matter of debate whether autophagy contributes to apoptosis, but increasing studies support that autophagy inhibition trigger p62-dependent intracellular death-inducing signaling complex(iDISC) formation on autophagosomal membranes and activate caspase8-induced apoptosis. Our previous studies have found that in addition to displatin sensibility human ovarian cancer SKOV3(parent) and SKOV3/DDP cells(cisplatin resistance) have difference in autophagic flux, endogenous p62 expression and the increase of cisplatin sensibility induced by autophagy inhibition. Thus we presume that autophagy inhibition up-regulates p62 accumulation, promotes iDISC formation and caspase8 activation, which fine-tune by the interaction between p62 and iDISC member proteins, eventually induces autophagy-dependent apoptosis and increases the ovarian cancer cell sensibility to cisplatin. By construction plasmid vector with truncating mutation in different domain of p62 and using gel filtration chromatography, co-immunoprecipitation and GST-Pull down assay, we compare SKOV3 with SKOV3/DDP on cell apoptosis and autophagy treatment with cisplatin, further investigate the caspase8 activation mechanism regulated by the interaction between p62 and different protein of iDISC. The research will elucidate the shift mechanism from cytoprotective autophagy to apoptosis via p62 expression and caspase8 activation mediated by autophagy and provide a new light on reversal of tumor multidrug resistance.

顺铂耐受是卵巢癌治疗的瓶颈。尽管自噬是否促进凋亡尚存争议，但近来研究发现抑制自噬可形成以p62为组织中心的细胞内死亡诱导信号复合体（iDISC）诱发自噬依赖性凋亡。我们发现，对顺铂敏感性不同的人卵巢癌SKOV3和耐顺铂SKOV3/DDP细胞间存在自噬流量、内源性p62表达及自噬抑制剂顺铂增敏效果的差异。因此我们推测：抑制自噬可通过p62蓄积性上调促进iDISC形成，而p62与iDISC组成蛋白相互作用可微调控caspase8活化，诱导自噬依赖性凋亡逆转细胞耐药。我们将在对比顺铂诱导SKOV3与SKOV3/DDP细胞凋亡与自噬的基础上，构建p62不同结构域缺失突变体，并结合凝胶过滤层析等技术手段，探讨p62与iDISC组成蛋白相互作用调控caspase8活化的机制。从自噬调控p62表达与caspase8活化的角度，阐明自噬由促存活向促凋亡转变的机制，为逆转肿瘤耐药提供新线索。

与多个重要细胞信号传导通路关键蛋白相互作用的信号衔接分子p62，虽不具备酶活性位点，但其依赖于选择性自噬的信号整合中心作用非常重要。本研究以多功能蛋白p62为切入点，基于临床卵巢癌患者标本及体内外实验研究，明确自噬依赖的p62介导的信号复合体通过对存活信号和死亡信号平衡的微调节，在卵巢癌细胞对经典化疗药物顺铂的敏感性变化中发挥关键性作用。p62作为多结构域衔接蛋白具有与泛素化蛋白结合的UBA结构域以及与LC3相互作用的结构域LIR，具有靶向特定K63-泛素化修饰的蛋白质并介导其经选择性自噬降解的作用。我们的研究发现，p62通过影响细胞内泛素化蛋白水平参与肿瘤细胞化疗耐受机制。在此基础上，进一步研究发现，p62可通过形成影响受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）泛素化形式的信号活化中心调控NFκB信号通路活性参与卵巢癌顺铂耐药机制，表明p62可通过募集K63-泛素化蛋白形成信号复合体，进而发挥整合信号传导的作用。应用氯喹抑制自噬降解功能可导致p62阳性的不可溶性蛋白聚集体大量堆积，从而形成一个由p62和大量泛素化蛋白构成的信号平台，该平台对于caspase-8活化及凋亡信号放大具有重要作用。特异性突变p62的UBA结构域和LIR结构域，会明显影响caspase-8活化及其介导的凋亡信号强度。基于临床患者组织标本的研究显示，单纯caspase-8蛋白表达变化无法提示患者预后，但在p62高表达的卵巢癌患者中caspase-8高表达预后优于caspase-8低表达。这提示我们，对于某一细胞内分子究竟是抑癌作用还是促癌作用，判断不只依赖于基因加减法，也需要考虑与其共同作用形成信号复合物的其他分子存在与否。卵巢癌目前仍缺乏可有效判断其预后的生物标志物。因此，从生物学视角看待卵巢癌发生发展的生物医学基础研究可为其预后判定及个体化治疗提供重要线索。p62虽然是公认的细胞内重要信号衔接分子，但因其不具备酶活性而不如与其密切相关的酶类分子受关注，但是基于我们对依赖p62的信号复合体在肿瘤中作用的研究表明，p62作为重要的细胞内信号衔接分子是临床肿瘤治疗中非常重要的辅助诊断标志物，有潜力成为靶向治疗的有效促进因素，及开发出全新卵巢癌生物标志物组合诊断方法。