PINK1-Parkin依赖的线粒体自噬在肺动脉高压中的作用及机制研究

Mitochondria play an important role in the development of pulmonary artery hypertension (PAH) by regulation of hypoxia oxygen sensor, glycolytic shift and apoptosis. Mitophagy mediated by PINK1/Parkin pathway is essential for the clearance of the damaged mitochondria and for the normal metabolism and function of cells. Mitochondrial fragment is the precondition of the mitophagy. Based on our preliminary results showing that mitochondrial fragment increased in the proliferated pulmonary artery smooth muscular cells (PASMC) with the enhanced mitopahgy under the hypoxia condition, we put forward the hypothesis that mitophagy could promote the development of PAH by strengthening the PASMC proliferation. The present study sought to investigate the effect of mitophagy mediated by PINK1/Parkin on the proliferation of the PASMC by overexpressing or siRNA and other cell biology techniques. Furthermore, the expressions alteration of mTOR and Bcl-2 during mitophagy was also investigated to explore the mechanisms of the PASMC proliferation promoted by mitophagy. In vivo experiment, the effect of mitophagy on the development of PAH was detected using the drug intervention and histochemistry methods to illuminate the mechanisms of the mitophagy in facilitating the development of PAH, to reveal the new role of the mitochondria in PAH, and to explore the novel targets for prevention and therapy of PAH.

线粒体在肺动脉高压(PAH)的发病中起重要作用，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除损伤线粒体保证细胞正常代谢和功能的必需手段。基于预实验发现低氧环境下肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖伴线粒体片段化增多、自噬增加的基础上，我们设想Parkin依赖的线粒体自噬可能影响PASMC增殖促进PAH的发生发展。本课题拟在细胞水平观察线粒体自噬对PASMC增殖的影响，应用基因过表达和siRNA等技术探讨mTOR和Bcl-2在线粒体自噬促进低氧诱导的PASMC增殖中的相关分子机制；在PAH模型，应用药物干预，通过组织化学和分子生物学方法，观察mTOR和Bcl-2是否影响线粒体自噬在PAH中的作用，从多个层面论证我们的设想。本研究将从线粒体自噬影响细胞修复和再生的观点，阐明Parkin介导的线粒体自噬促进PASMC增殖的作用和机制，揭示线粒体在PAH发病中的新作用，为该病的临床防治提供新策略。

线粒体在肺动脉高压(PAH)的发病中起重要作用，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除损伤线粒体、保证细胞正常代谢和功能的必需手段。..基于预实验发现低氧环境下肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖伴线粒体片段化增多、自噬增加，本项目在细胞水平观察线粒体自噬对PASMC增殖的影响，应用基因过表达和siRNA等技术研究了mTOR和Bcl-2在线粒体自噬促进低氧诱导的PASMC增殖中的相关分子机制；并通过建立PAH模型，应用相关的拮抗药物进行干预，研究了线粒体自噬通过影响mTOR和Bcl-2在PAH发生发展中的作用。..本研究发现：低氧环境下培养的细胞线粒体收缩分裂，片段化增多，可见点状线粒体，此为线粒体自噬的前提。低氧下线粒体膜电位降低，是Parkin从胞浆转位到线粒体膜介导自噬发生的必要条件。低氧可以诱导PASMC增殖，细胞DNA大多处于复制阶段；细胞增殖指数明显高于常氧培养的细胞。低氧培养的细胞表达HIF-1α增多，免疫金电镜结合 PCR 和 Western blot 分析的线粒体自噬相关指标发现自噬产物LC3II、LC3II/LC3I 和 P62增加，进行线粒体自噬的定性和定量化，发现低氧环境培养的细胞增殖增加和细胞线粒体的自噬增加有关。siRNA 减低 Parkin 的表达发现细胞增殖减慢，而外源性基因转染使 Parkin 过表达，细胞线粒体自噬和细胞增殖均增加、细胞凋亡减少。基本可以确定 Parkin 介导的线粒体自噬增加影响了低氧诱导的 PASMC 增殖；低氧环境下 PASMC 中 的 Parkin、Bcl-2 和 mTOR 的表达增加，且与低氧时间正相关，用 Bcl-2 的抑制剂 TW37，mTOR 的抑制剂 XL388 及其上游基因 Akt 的抑制剂 LY294002 进行处理后，细胞的自噬减少，PASMC增殖减轻。在低氧诱导的PAH 鼠模型，造模成功后HIF-1α 的表达随时间增长而增加，肺动脉血管细胞增殖相关指数与细胞自噬标记物成正相关，说明Parkin介导的线粒体自噬通过Bcl-2 和 mTOR促进PASMC增殖。..本项目从线粒体自噬影响细胞修复和再生的观点出发，通过各种方法影响线粒体自噬，阐明了Parkin介导的线粒体自噬促进PASMC增殖的作用和机制，揭示了线粒体在PAH发病中的新作用，为该病的临床防治提供了新的应对策略。