伴放线放线杆菌CDT蛋白及其信号转导通路诱导人T淋巴细胞凋亡的机制研究

伴放线放线杆菌（Aa）是局限型侵袭性牙周炎的主要致病菌，其产生的细胞致死性扩张毒素（CDT）可杀灭活化的淋巴细胞而发挥免疫抑制作用，在侵袭性牙周炎的发生发展过程中意义重大，但其诱导淋巴细胞凋亡的机制尚未阐明。结合文献回顾和既往工作，我们认为Aa CDT毒力亚基上的DNase I和PIP3两种毒性作用的发挥是被不同的信号分子识别而启动相应的信号转导途径，最终导致靶细胞凋亡的结局。为验证此推论，本研究拟通过定点突变技术获得DNase I和PIP3活性缺失的突变型全毒素，以此为对照，采用基因芯片和蛋白芯片筛选野生型Aa CDT诱导人T淋巴细胞系凋亡的主要信号转导通路及关键信号分子，并选用相应信号通路抑制剂进行阻断实验反向验证，研究结果不仅对阐明Aa CDT诱导淋巴细胞凋亡的机制具有重要意义，也有望为侵袭性牙周炎治疗提供潜在的新靶标。

牙周炎是侵犯牙周支持组织的慢性炎性疾病，是导致成人失牙的主要原因之一，在世界范围内患病率较高。各型牙周炎中，侵袭性牙周炎具有发病年龄早、病变进展快、易造成牙周组织迅速破坏、导致牙齿早期松动脱落等特点而受到口腔科医生越来越多的关注。伴放线聚集杆菌是局限型侵袭性牙周炎的主要可疑致病菌，也是目前发现的唯一能表达CDT的口腔细菌。伴放线聚集杆菌CDT可以引起口腔上皮细胞G2/M期阻滞,牙龈成纤维细胞、牙周韧带细胞G1期、G2/M期的阻滞,诱导细胞凋亡。伴放线聚集杆菌CDT由A、B、C三个亚基（CdtA、CdtB、CdtC）按物质的量比1:1:1构成的异源三聚体复合物。近期研究表明，CdtB具有DNaseⅠ和PIP3活性，从而能导致多种细胞发生凋亡，如上皮细胞，巨噬细胞及T淋巴细胞。值得注意的是，不同类型的细胞对CDT的敏感性不同。人牙周膜细胞及牙龈成纤维细胞对CDT较不敏感，而活化的T淋巴细胞对CDT的敏感是Hela细胞的约5-10倍，表明了T淋巴细胞可能是伴放线聚集杆菌CDT的主要靶细胞。由此，我们推测伴放线聚集杆菌表达的CDT可以诱导活化T细胞的凋亡、干预保护性的免疫应答，从而参与了局限型侵袭性牙周炎的发生和发展。本研究成功完成了伴放线聚集杆菌野生型CDT基因和突变型CDT基因的克隆、表达、分离、纯化和全毒素的体外重构；同时验证了突变型CdtB蛋白的DNaseⅠ和PIP3活性；用透射电镜、激光共聚焦及流式技术等验证了CDT蛋白对Jurkat细胞的毒性作用；运用 iTRAQ技术筛选了表达差异的凋亡相关蛋白，并进行相应的分析，得出了一条可能的信号转导通路（ Ubc9/ p53/ DR5/ Caspase-8/Caspase-3 ）；通过实时逆转录PCR及蛋白质印迹技术对筛选的信号通路的信号分子进行了验证；最后再用过表达及RNA干扰技术对通路进行了验证。本研究筛选了伴放线聚集杆菌CD诱导T淋巴细胞凋亡过程中的关键信号分子及一条可能的信号转导通路，并加以验证，为临床治疗LAgP提供新思路。