胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIVA在猪肺上皮细胞表面受体鉴定及其信号转导通路解析

Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) is the causative agent of porcine pleuropneumoniae,which causes swine massive death and is responsible for large economic losses in pig industry worldwide. A. pleuropneumoniae can secrete different combinations of four exotoxins (ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, and ApxIVA) belonging to the RTX toxin family. ApxIVA has been demonstrated to present in all 15 serovars of A. pleuropneumoniae, however, it is only expressed under in vivo conditions. Apx exotoxins are important pathogenic virulence factors of A. pleuropneumoniae, but the molecular pathogenic mechanisms of Apx exotoxins, especially ApxIVA during A. pleuropneumoniae infection remain unclear. So this project will focus on research on the effect of ApxIVA on cell growth, gene expression and protein interaction in the porcine lung epithelial cell line（SJPL） by transcriptome analysis (RNA-Seq), yeast two-hybrid, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and so on. This research will elucidate the effect of ApxIVA on gene differential expression of the cells; reveal the cell receptor of ApxIVA and the protein interaction in the cells. The research results will show the signal transduction pathways in the porcine lung epithelial cells stimulated by ApxIVA, and illustrate the molecular pathogenic mechanisms of ApxIVA finally.

猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）是引起猪胸膜肺炎的病原菌，APP感染常造成大量猪死亡，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。APP可分泌4种外毒素即ApxIA、ApxIIA、ApxIIIA和ApxIVA，但只有ApxIVA存在于所有15个血清型APP中，而且ApxIVA只能在APP感染动物的体内环境条件下才能获得表达。尽管Apx外毒素是APP的主要致病毒力因子，但国内外研究者对Apx外毒素特别是ApxIVA在APP感染过程中的分子致病机制仍不清楚。因此，本项目拟以ApxIVA和猪肺上皮细胞系为研究对象，采用转录组分析、酵母双杂交和双分子荧光互补等技术，开展ApxIVA对细胞生长、基因表达的影响及蛋白质互作的研究， 阐明ApxIVA对靶细胞基因差异表达的调控作用，揭示ApxIVA的细胞表面受体和相关蛋白互作网络，解析靶细胞内与ApxIVA相关的信号转导通路，达到阐明ApxIVA分子致病机制的目的。

猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌，在APP分泌的四种Apx外毒素中（ApxIA、ApxIIA、ApxIIIA和ApxIVA），ApxIVA存在于所有血清型APP细菌内，但体外培养（in vitro）APP不表达ApxIVA，APP只有在感染动物体内环境条件下（in vivo）才能表达该蛋白（～202KDa）。因此，为探索ApxIVA的分子致病机制，本研究以ApxIVA和猪肺上皮细胞SJPL细胞为研究对象，开展了ApxIVA的相关研究，取得如下结果： .⑴ 采用体外同源重组法成功构建了4种原核表达重组质粒。在优化原核表达条件下（37℃ 1mM IPTG诱导3h）初步纯化获得四种ApxIVA重组蛋白（ApxIVA、ApxIVA/ORF1、ApxIVA/ApxIC、ApxIVA/ApxIIC）。对所构建的7种真核表达重组质粒在SJPL细胞中的瞬时表达进行了初探。.⑵ 利用获得的ApxIVA分析其溶血活性及对SJPL细胞的影响，结果显示：①只有与ORF1共表达的ApxIVA即ApxIVA/ORF1才表现出弱的溶血活性和协同溶血效应，且对猪红细胞比绵羊红细胞有更强的溶血能力。② 四种ApxIVA重组蛋白中，ApxIVA、ApxIVA/ApxIC、ApxIVA /ApxIIC对SJPL细胞形态、生长及活性没有影响，ApxIVA/ORF1则导致细胞数量明显减少、细胞皱缩变圆等现象，抑制细胞生长且活性降低，且这些影响与凋亡无关。可见，只有与ORF1共表达的ApxIVA才具有溶血活性并能对SJPL细胞产生影响，表明ORF1发挥着激活外毒素ApxIVA的作用。.⑶ 为从分子水平剖析ApxIVA激活机制，通过SDS-PAGE电泳分离纯化ApxIVA、ApxIVA/ORF1中的ApxIVA，切取ApxIVA胶条，采用质谱法对ApxIVA进行乙酰化修饰分析，结果表明：ApxIVA/ORF1与ApxIVA之间的乙酰化修饰没有差异。表明ApxIVA通过非乙酰化修饰激活。.⑷ 通过提取猪肺组织总RNA，经RT-PCR、LD-PCR获得双链cDNA，与线性化质粒pGADT7-Rec共转酵母感受态细胞，经培养基筛选和PCR鉴定，成功建立了猪肺组织酵母双杂交cDNA文库，该文库的建立为后续ApxIVA与SJPL细胞蛋白互作研究奠定了基础。