A20基于细胞自噬调控牙周炎骨破坏的相关机制研究

Periodontitis is a chronic infectious inflammatory disease characterized by periodontal tissue destruction,among which the most important clinical character is alveolar bone loss. We make the following conjecture based on the previous literature reading and research results: A20 is involved in the inhibition of the human periodontal ligament fibroblasts(hPDLCs) RANKL/OPG expression, thus inhibiting its ability to promote osteoclast precursor cells differentiation under hypoxia condition,which exerts its' regulation of periodontitis bone metabolism . We suppose that autophagy may be involved in the process of hPDLCs osteoclastogenesis tendency by HIF-1α/BNIP3 pathway under hypoxia condition.A20 may inhibit Beclin1 protein activation through link with TRAF6,thus inhibiting autophagy . Our topic aims to study the possible regulation mode of autophagy and A20 in periodontitis bone destruction mechanism under hypoxia condition,through explore the possible signaling pathways and key signaling molecule,we would like to clarify that A20 may be involved in regulating the inhibition of periodontitis bone destruction by inhibiting autophagy. This study is expected to deeply explore the role of autophagy in periodontitis bone destruction, implying A20 as a potential target of periodontitis treatment, and provide a new thought and concept of looking for new periodontitis treatment targets.

研究发现，泛素化酶A20具抗炎作用，A20与自噬存在相互抑制的关系，而自噬可在乏氧情况下促进破骨分化。因厌氧微生物聚集、牙周袋形成及局部微循环障碍会形成牙周炎症组织局部乏氧的微环境，乏氧状态对牙周炎的发生发展有重要影响，课题组前期研究已发现hPDLCs可发挥类似成骨细胞功能，促进破骨分化，A20活化可抑制常氧状态下hPDLCs促破骨分化的能力。但乏氧状态下，自噬对hPDLCs促破骨细胞前体分化的能力有何影响？A20如何调控hPDLCs的自噬？其相关的信号通路是什么？本课题拟通过建立体外hPDLCs与破骨前体细胞共培养体系，研究乏氧状态下自噬以及A20在牙周炎骨破坏机制中可能的调控模式；通过A20基因敲除/过表达小鼠模型构建实验性牙周炎动物模型进行体内验证，意在阐明乏氧状态下，A20可能通过抑制自噬参与调控抑制牙周炎骨破坏，明确潜在机制，并进一步为探寻新的牙周炎治疗靶点提供新的思路。

牙周炎是以牙齿周围牙槽骨破坏为特征的慢性炎症性疾病。泛素编辑酶A20，又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（Tumor necrosis factor-α induced protein 3, TNFAIP3），逐渐成为炎症反应和自身免疫性疾病的关键调节分子。A20可以通过泛素和去泛素修饰来调节自噬。此外，A20可通过多种机制限制NLRP3炎症小体信号通路的活性。A20还能抑制M1巨噬细胞极化过程。自噬、NLPR3炎症小体信号通路和巨噬细胞极化均参与炎症反应和骨代谢。本项目旨在探究A20能否成为牙周炎的治疗靶点及潜在的机制。.通过在小鼠牙周组织中局部注射靶向A20的腺相关病毒（AAV），探究A20对C57BL/6J小鼠实验性牙周炎的影响。乏氧条件下，利用转染A20敲低/过表达慢病毒的人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament cells, hPDLCs），构建hPDLCs和骨髓源性单核细胞（bone marrow mononuclear cells, BMMCs）共培养体系，探索A20、TRAF6、自噬、RANKL/OPG（R/O）比值及破骨细胞生成之间的关系。通过western blot、Co-IP等实验验证A20与TRAF6之间的内在关系。利用A20敲低/过表达的人髓系白血病单核细胞（human myeloid leukemia mononuclear cells, THP-1）细胞探索A20对Pg. LPS/IFN-γ诱导的M1巨噬细胞极化及NLRP3炎症小体信号通路的作用。采用MCC950预处理Pg. LPS/IFN-γ刺激的THP-1细胞进一步揭示NLRP3炎症小体通路在A20调控的M1巨噬细胞极化中的扮演的角色。构建实验性牙周炎小鼠模型，并进行免疫组化染色等组织学实验，进一步验证A20、自噬、NLRP3炎症小体信号通路及巨噬细胞极化的相互联系。.研究结果表明，A20抑制结扎诱导的实验性牙周炎造成的小鼠牙槽骨丧失。乏氧下，A20可能通过抑制TRAF6依赖性自噬，下调hPDLCs促破骨分化活性，从而减少破骨细胞生成。此外，A20能减轻THP-1细胞中NLRP3介导的M1巨噬细胞极化。动物体内实验结果证实，A20对实验性牙周炎小鼠牙周组织中发生的自噬、NLRP3炎症小体信号通路和M1巨噬细胞极化均有抑制作用。.本实验全方位，多角度深入探讨