行气活血法中药预知子调节肝癌细胞核糖体蛋白表达的机制探索

It has been found in our recent research work that traditional Chinese medicine -Fruit of Fiverleaf Akebia would stop proliferation of liver cancer cells. The results of expression profiling genechip showed that a large number of genes expressions changed, which included some ribosomal proteins (RPs) genes. A lot of recent study revealed that RPs involved in DNA replication, transcriptional regulation and cell proliferation in addition to protein synthesis. Based on the above theories and research results, Fruit of Fiverleaf Akebia may influence primary liver cancer cells' biology function through regulating the expression of RPs. The project would explore the role of 10 RPs in hepatoma cell proliferation process and the regulating effect of Fruit of Fiverleaf Akebia, by means of the methods such as RNAi, over-expression, expression profiling genechip, MTT, flow cytometry (FCM), RTqPCR and Western blot etc. The research work will further elucidate the mechanism of liver cancer and the effect of material medica-Fruit of Fiverleaf Akebia on prevention and treatment of liver cancer. The study also has a very important academic significance and application value.

项目组在近期的研究中发现行气活血法的常用药- - 预知子（Fruit of Fiverleaf Akebia）提取物会引发肝癌细胞增殖停滞，表达谱芯片检测结果显示大量基因表达发生改变，尤其是部分核糖体蛋白的基因表达变化明显。近期国内外研究表明，核糖体蛋白除了参与蛋白合成之外，还具有多种核糖体外功能，如复制、转录调控和细胞增殖等。据此，中药预知子对肝癌细胞生物学行为的影响可能在一定程度上是通过调节核糖体蛋白基因的表达实现的，综合运用RNAi、过表达、表达谱芯片、MTT、流式细胞仪、RTqPCR、Western bolt等技术，有助于探索待检10个核糖体蛋白在肝癌细胞增殖过程中的作用，及预知子对其调节的意义，这对于深入阐明肝癌恶性增殖的机制和行气活血法代表中药预知子防治肝癌的作用机理，均具有非常重要的学术意义和应用前景。

在国家自然基金资助下，课题组既往研究发现，预知子提取物可使肝癌细胞的增殖停滞，通过表达谱芯片检测发现，有94个基因的表达发生改变（上调或下调幅度为10%），其中有20个为核糖体蛋白基因。为了进一步探究核糖体蛋白在肝癌细胞增殖停滞中的具体作用及其机制，本课题围绕以下工作展开研究：.挑选15个表达改变的核糖体蛋白基因（RPSA、RPL6、RPS29、RPS26、RPL17、RPS8、RPS13、RPL10、RPS6KA3、RPS3A、RPL10A、RPLP0、RPL19、RPL15、RPS16）作为目标基因，通过RNAi技术沉默上述基因表达，采用MTT、WB、TUNEL、FCM、芯片技术等检测目标基因沉默后肝癌细胞的生物学改变及基因表达谱改变情况。研究结果显示，RPL6、RPL10、RPS8、RPS13沉默后，肝癌细胞出现不同程度的增殖停滞，且与阴性对照相比，RPL6沉默后有62个基因上调、33个基因下调（Fold Change绝对值≥1.5且FDR<0.05），RPL10沉默后有48个基因上调、37个基因下调（Fold Change绝对值≥1.5且FDR<0.05），RPS8沉默后有105个基因上调、11个基因下调（Fold Change绝对值≥1.5且FDR<0.05），RPS13沉默后有19个基因上调、13个基因下调（Fold Change绝对值≥1.5且FDR<0.05），其中EGR1、DCN、CA9、NDRG1基因表达均上升，IL8、GJA1基因表达下降。以上变化涉及多个信号通路及生物进程，推测核糖体蛋白可能参与多种基因表达调控从而影响肝癌细胞增殖，其具体的作用机制还有待进一步的研究，本项目为核糖体蛋白的核糖体外功能研究提供了新的理论依据及实验证明。