肿瘤来源的内源性蛋白类TLR4配体的捕获与鉴定

Toll样受体 (TLR)主要表达于免疫及上皮细胞，识别病原相关分子模式，中介机体对各种病原微生物的免疫学反应。某些肿瘤细胞也表达TLR，激活其TLR信号促进肿瘤细胞的生长和免疫逃逸。然而，大多数肿瘤细胞并不直接接触微生物或其组分，那么启动这些细胞TLR信号的调节因子是什么？是否存在肿瘤来源的特异性TLR配体? 我们前期研究发现某些肿瘤细胞培养上清可激活TLR4，可能存在肿瘤来源的内源性TLR4调节因子，而且这种调节因子对热敏感，提示可能为蛋白质。本课题在前期研究的基础上，通过重组表达TLR4 及其辅助分子作钓饵，采用蛋白质组学研究新方法- - 配体垂钓技术捕获并鉴定可能来源于肿瘤的蛋白多肽类TLR4配体，证明其对TLR4信号通路的激活效应。研究对阐明肿瘤细胞TLR表达及其信号在肿瘤发生发展中的作用，指导肿瘤防治具有重要意义，同时可初步从生化水平上提供内源性配体与TLR直接相互作用的证据。

课题首先按照研究计划采用Biacore T100生物大分子相互作用分析仪捕获来源于肿瘤的TLR4蛋白多肽类配体。将真核表达的重组人TLR4-MD2复合物通过氨基偶联到生物大分子相互作用分析仪BIAcore T100芯片表面为钓饵，将人肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L02，以及卵巢癌OVCAR-3，子宫颈鳞癌细胞SiHa等肿瘤细胞，采用无血清处理诱导细胞凋亡坏死，制备可能存在内源性配体的肿瘤细胞培养上清。将肿瘤细胞培养上清加到偶联了TLR4-MD2复合物的芯片表面，通过芯片表面固定的TLR4-MD2复合物从溶液中俘获可能来源于肿瘤细胞的TLR4配体。结果发现，外源性TLR4配体LPS能很好地与偶联在芯片表面的受体结合，但多种肿瘤细胞培养上清均未检测到与受体的结合，上清浓缩后仍无明显结合存在。同时我们开展了肿瘤相关的内源性TLR4配体HMGB1的研究。应用免疫细胞化学的方法在妇科脱落细胞学样品制备的细胞块上检测HMGB1的表达，分析检测HMGB1在宫颈癌前病变及宫颈癌诊断及鉴别诊断中的意义。 结果表明HMGB1在宫颈上皮内瘤变（CINs）和宫颈癌(ISCCs)中的检出率逐渐增高，表明通过制备妇科脱落细胞学样品细胞块检测HMGB1表达对辅助诊断CINs和ISCCs有帮助， HMGB1有可能作为一个潜在的标记分子用于宫颈上皮损伤的诊断和鉴别诊断（论文Diagnostic Cytopathology已修稿）。另外，结合本课题组对TLR4与子宫颈癌的研究，总结了TLR信号在肿瘤发生和发展中的作用，讨论了外源性或内源性TLR配体，谁在肿瘤发生中发挥更重要作用(Cell Mol Life Sci. 2012;69: 935-49)，指出TLR在肿瘤中的作用具有双面性(Biochim Biophys Acta. 2013;1835:144-54).