长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)氧胁迫响应机理的蛋白质组解析与差异蛋白基因的表达研究

本研究以我国百岁健康老人肠道优势长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BBMN68(CGMCC2265)菌株为研究对象，在完成全基因组测序的基础上，以蛋白质双向凝胶电泳(2D-PAGE)、基质辅助激光时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)和酶解多肽质量指纹鉴定(PMF)技术为基础的蛋白质组学方法，研究该菌株在不同氧分压和过氧化氢浓度胁迫处理下，菌体生长过程中全细胞蛋白质组的差异变化；以定量荧光差异凝胶电泳(DIGE)、实时定量RT-PCR技术相配合，追踪包括DnaK、GroESL和Clp等分子伴侣-蛋白合成质量控制体系、基础糖代谢途径酶系和外围相关调控因子在内的所有可能有效鉴定的差异蛋白质及其基因表达的变趋势，解析和探讨以功能蛋白质组变化为基础的长双歧氧胁迫响应机理。为进一步提高长双歧氧胁迫下的生存能力、培育高耐氧长货架期具有自主知识产权系列菌株的相关研究，提供参考。

双歧杆菌（Bifidobacteria）是重要的食品工业微生物，属于革兰氏阳性不运动具分枝的厌氧细菌，是消化道（gastrointestinal tract）定殖的主要益生菌（probiotics）（Picard et al., 2005）。由于双歧杆菌基因组缺少呼吸链、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（KAT）(星状双歧杆菌除外)等，具有NADH氧化酶（催化H2O2的形成）和游离Fe2+，经Fenton反应生成OH•和OH¯等活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）等代谢途径，使双歧杆菌对各种氧化胁迫极其敏感（Nishiyama et al., 2001；Kawasaki et al., 2006，2009；He et al., 2012）。长双歧杆菌是具有代表性和重要经济价值的益生菌，而对氧的不耐受是影响其在食品工业中应用的重要限制因素之一，研究双歧杆菌抗氧化胁迫对食品微生物工业加工具有重要意义。.尽管前人在双歧杆菌对多种胁迫的耐受机理方面都进行了研究，然而，总体来看，对双歧杆菌的氧胁迫响应的整体研究，如蛋白质组、转录组和代谢组等的研究鲜见报道，对菌株整体响应氧胁迫机制和限制机理尚不清晰，对双歧杆菌氧胁迫下的功能组分表达和基础代谢调控模式还不完全清楚。.长双歧杆菌BBMN68是从我过健康百岁老人肠道分离得到的一株具有诸多益生功能的野生菌株（Yang et al., 2009），对氧较为敏感的菌株。本课题以BBMN68为出发菌株，通过蛋白质组和转录组学分析，探讨了其氧胁迫响应方式和调控途径。另外，通过体外体内实验验证Dps对防止核酸氧化损伤以及AhpC清除内源性过氧化物起到至关重要的作用。研究结果表明，DNA 氧化损伤保护蛋白，如DNA 结合铁蛋白，核苷酸还原酶，和NTP 焦磷酸水解酶；氧化损伤RNA 的清除蛋白，如多核苷酸磷酸化酶和烯醇酶；氧化胁迫保护蛋白，如烷基过氧化物还原酶C22，硫氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶体系和吡啶二硫核苷酸还原酶；以及氧化保护蛋白等，构成了BBMN68 细胞的抗氧化防御体系。.本研究为理解双歧杆菌氧胁迫响应机理提供了重要的参考，为进一步从基因表达和代谢调控上改善长双歧杆菌氧胁迫的响应方式和氧胁迫下的综合生存能力，培育长货架期功能菌株和具有自主知识产权的工业菌株的研究，提供理论支持和参考。