Gcm2对可复性永生化甲状旁腺细胞功能与分化的调控

Without any effective cure for the time being, transplantation of parathyroid cells is thought to be a promising therapy for hypoparathyroidism. However,the cell source shortage limits its application. Reversible immortalization technique provides an effective means to solve this problem. PiggyBac transposon vector system has recently been developed for transgenes. By taking advantage of the natural propensity of the PB system for seamless excision, transforming gene(s) can be imported into the cell genome for immortalization and amplification, then accurately knocked out under controlled conditions without a trace, eliminating the safety concerns caused by the exogenous DNA fragments. Even so, after reverting, differentiation and function status of these cells often fails to achieve the desired level for transplantation probably due to epigenetic changes. Fortunately, Gcm2 has newly been found to play a key role in the embryonic organogenesis and mature cells functioning in parathyroid glands, indicating that it would be beneficial to the recovery in differentiation and function of parathyroid cells. Therefore, we are planning to reversibly immortalize parathyroid cells for amplification by the PiggyBac transposon vector system, employ Gcm2 to regulate the differentiation and function of these cells and study the cytological mechanisms underlying these effects using ChIP technology. The research described above will provide theoretical and experimental evidence for establishing a safe technological system to yield functionally mature seed cells for the parathyroid transplantation.

甲状旁腺功能减退症至今仍缺乏有效治疗手段，甲状旁腺细胞移植可能是该症目前最有希望的疗法，但供体细胞来源匮乏的问题限制了其应用。我们前期的工作提示，细胞可复性永生化技术可能是目前该问题较为有效的解决方案。新近发展的PiggyBac转座子载体系统可以导入转化基因并在需要时不留痕迹地敲除之，消除了外源性基因残留带来的安全性顾虑。但回复后细胞表观遗传改变造成的细胞功能和分化状态的变化成为该技术另一个缺陷。有幸的是近年来发现Gcm2在甲状旁腺细胞胚胎发育和成熟细胞功能维持上具有关键性作用，因而对永生化回复后甲状旁腺细胞也应具有相应的作用，从而使之获得较为成熟的分化和功能表型。本研究在利用上述改良的可复性永生化技术获得足量甲状旁腺细胞的基础上，观察Gcm2调控回复后细胞的功能与分化状态进而利用ChIP技术揭示其可能机制，旨在为进一步探索安全、功能成熟的甲状旁腺种子细胞的制备研究提供一定理论和实验依据。

至今，甲状旁腺功能减退症仍缺乏有效的对因治疗手段，临床以长期口服钙剂和维生素D制剂为控制病情的常规方案。提出的众多新治疗方案中，甲状旁腺细胞移植可能是该病症最有希望的疗法。细胞移植治疗常遭遇供体细胞来源匮乏的问题；同时，如何保证所移植细胞的分化和功能状态也是细胞移植治疗成功与否的关键。.本课题一方面尝试以PiggyBac 转座子载体系统向甲状旁腺细胞导入转化基因，以期获得可无痕消除外源性基因的永生化种子细胞；另一方面针对在甲状旁腺细胞分化中起关键作用的Gcm2基因展开研究，揭示其功能和相关调控机制，从而为调节甲状旁腺细胞的分化和功能状态奠定基础。.课题组首先针对甲状旁腺微小难寻的问题，应用实践了依赖5-氨基乙酰丙酸的甲状旁腺示踪方法。同时还发现，可用630 nm激光照射甲状旁腺部位，利用5-氨基乙酰丙酸的光动力学效应，特异的杀伤甲状旁腺细胞，作为治疗甲状旁腺功能亢进症的可能方案。.能寻获和短期培养甲状旁腺细胞后，课题组结合腺病毒高效转染和PB转座子稳定转染及可回复的优点，发展出了Ad-PB 混合载体系统，多次尝试诱导甲状旁腺细胞的永生化。携带永生化基因SV40LTAg 的Ad-PB 混合载体系统虽未能诱导大鼠原代甲状旁腺细胞永生化，但成功实现小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的永生化及回复；携带小鼠leptin 基因的Ad-PB 混合载体系统亦能有效治疗纠正ob/ob 小鼠的肥胖表型。.Gcm2基因除在甲状旁腺发育过程中发挥关键作用外，在成体甲状旁腺中仍然持续表达，提示其可能调控甲状旁腺功能。课题组对继发性甲状旁腺功能亢进症大鼠模型的甲状旁腺进行了检测，发现Gcm2表达量发生明显改变。在此基础上，从美国Jackson实验室引进了Gcm2tm1.1Malx/J小鼠，与Cre-ER工具小鼠一同繁育成可诱导条件性基因敲除小鼠。通过在成年期敲除Gcm2基因，我们发现小鼠甲状旁腺分泌的甲状旁腺激素大量减少，而胸腺开始分泌甲状旁腺激素。对于这一发现，我们正在对Gcm2调控成年期小鼠甲状旁腺分泌的机制展开进一步研究。通过4年多的工作，摸索完善了研究大鼠和小鼠甲状旁腺所必需的技术方案，建立了Gcm2基因功能研究的动物平台， 为后续研究提供了前进方向和坚实基础。