人肝细胞核因子4alpha调控永生化肝细胞功能与分化的机制研究

永生化肝细胞是较为理想细胞材料之一。肝细胞核因子4alpha（HNF4a）在肝细胞的功能、表型及分化中起重要作用。通过前期研究我们发现并证实了HNF4a表达可诱导永生化肝细胞高效分化，HNF4a基因阳性表达筛选可建立高分化永生化肝细胞系；然而目前HNF4a调控永生化肝细胞功能与分化的分子机制仍未阐明。通过生物信息学分析发现β-catenin内含子区存在HNF4a的结合位点，因此我们进而推测在永生化肝细胞分化与增殖中β-catenin可能是HNF4a的下游作用分子。本研究在前期基础上进一步明确HNF4a对Wnt/β-catenin信号转导通路的作用；及Wnt/β-catenin信号通路受HNF4a调控对永生化肝细胞功能与分化的影响；最终通过永生化肝细胞微囊移植研究其对大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用。实验目的是明确HNF4a对永生化肝细胞功能与分化的内在机制和规律，为临床应用奠定坚实的理论基础。

肝细胞移植是治疗肝功能衰竭的有效方法，但供肝细胞来源缺乏、保存困难、细胞增殖力差、移植后免疫排斥反应限制其在临床的使用和疗效。永生化肝细胞克服了以上诸多不足，是较为理想细胞材料之一，但其仍存在其分化状态和表型的不稳定性等缺陷。本课题首次采用“离体两步胶原酶法”分离获得大量高活性成人原代肝细胞，自主研发设计了“肝细胞大规模培养和冻存的装置”，解决了肝细胞大规模培养的问题，并获国家发明专利授权；为解决肝细胞来源和数量的难题，成功建立人源性永生化肝细胞系，从细胞活性、形态及功能等方面检测结果与原代肝细胞相近；为增强永生化肝细胞功能与分化，采用比较蛋白质组学的方法发现决定永生化肝细胞分化与功能的关键基因（HNF4a），验证了HNF4a可增强永生化肝细胞的功能及分化状态，阐明其机制为HNF4a特异性地结合β-catenin基因的启动序列，进而调Wnt/β-catenin信号通路的活动。最后建立大鼠急性肝功能衰竭模型，利用微囊发生器制作海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊，将永生化肝细胞包裹其中，发挥微囊的免疫隔离和固定作用，完成永生化肝细胞微囊移植治疗大鼠急性肝功能衰竭体内实验，结果显示HNF4a过表达组永生化肝细胞微囊移植治疗效果明显优于单纯的永生化肝细胞移植组。本项研究从肝细胞的来源、冷冻保存、数量与活力、功能与分化以及体内移植等方面展开了系统深入的研究，并进一步阐明了永生化肝细胞肝脏分化的内在机制，为今后临床应用奠定了坚实的理论与实践基础。