Ang1/Ang2失衡促周细胞丢失在肝肺综合征微血管扩张中的作用和机制研究

Hepatolpumonary syndrome (HPS) is difficult to cure, whose main pathological alteration is intrapulmonary microvascular dilation (IPVD). Pericytes-dropout leads to many kinds of abnormal microvascular dilation, Ang2 increase and competes with Ang1 to combine with Tie2 receptor is the most important pathway which led to pericytes-dropout, but the mechanism is unclear. Due to Cx43 reduction plays a key role in pericytes-dropout and our previous data found pulmonary pericytes and Cx43 activation were decreased and serum Ang2 was increased significantly in experimental HPS rats. Thus, we hypothesized that Ang2 highly produced in diseased liver and releases to circulation, combines to and inhibits pulmonary Tie2 activation, then leads to Cx43 inactivation, pericytes-dropout, and as a result of IPVD. ECs and pericytes co-culture model and HPS rat model will be constructed and treated with exogenous Ang1 and Ang2 protein, Ang2 neutralizing antibody, Cx43 inhibiitor, agonist, siRNA and DNA transfection. Western blot, immunofluorescence, RT-PCR, ELISA, electron microscopy, Co-IP, mass spectrometry, point mutation, living cells imaging and new optogentical tool-LARIAT will be employed in this study. The aim of this study is to clarify the role and mechanism of Ang1/Ang2 imbalance induced pericytes-dropout in IPVD, which may be a new target for HPS prevention and treatment.

肝肺综合征（HPS）治疗困难，其主要病理特征是肺内微血管扩张（IPVD）。周细胞丢失是多种微血管异常扩张的重要原因，Ang2异常升高与Ang1竞争性结合Tie2受体是周细胞丢失的重要通路，但机制不详。Cx43是维持内皮细胞与周细胞稳态的关键环节；预实验显示HPS模型肺微血管周细胞数量和Cx43活性显著减少，血清中Ang2显著升高。因此推测：病肝产生大量Ang2→竞争性结合肺Tie2→Cx43失活→肺微血管周细胞丢失→IPVD形成。本课题拟建立HPS在体模型、周细胞与内皮细胞共培养模型，用Ang1、Ang2和Ang2中和抗体以及Cx43激动剂、抑制剂、siRNA和DNA干预，WB、RT-PCR、ELISA、免疫荧光、电镜、Co-IP、质谱、点突变、活细胞信号动态追踪、光遗传学LARIAT等技术研究Ang1/Ang2失衡促周细胞丢失在IPVD中的作用和机制，以期为HPS的防治提供理论依据。

肝肺综合征（HPS）是在慢性肝病和/或门脉高压基础上出现以气体交换障碍、难治性低氧血症为主要表现的一种综合病症。HPS的发生显著地增加了肝病病人的死亡率，目前唯一有效的治疗方法是肝移植。因此，研究其发病机制具有重要意义。胆总管结扎（CBDL）诱导的肝硬化是目前公认的HPS动物模型，肺微血管扩张和血管新生是CBDL诱导HPS的主要病理特征。硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝硬化不形成HPS，且TAA对肺脏没有损伤。因此，本项目对比CBDL和TAA大鼠模型，探索HPS的发病机制。首先，两个者都形成典型的肝硬化表现，但只有CBDL形成进展性的HPS，而TAA在4wk 时发生一过性HPS。既往研究发现周细胞是调节微血管管径和血流的关键细胞，因此，推测周细胞丢失导致了HPS肺微血管扩张的形成。但是，周细胞标记蛋白desmin、PDGFR-β在CBDL和TAA肺组织中表达升高，不能解释微血管扩张的形成。对肺组织染色，发现微血管计数标记蛋白（VWF、CD34、CD31）很难判断微血管数量；且与血管新生有关的蛋白（PCNA、VEGF、VEGFR）在CBDL和TAA大鼠肺组织中均显著升高，与HPS的症状不一致；这些结果不支持微血管新生参与了HPS的形成。然而，从CBDL 1wk开始，肺炎细胞聚集逐渐增多，TAA 4wk时肺炎症细胞一过性增多，该变化与HPS的发生发展高度一致。进一步研究发现中性粒细胞是CBDL 1wk、2wk、3wk和TAA 4wk的主要炎症细胞，M2巨噬细胞是CBDL 4wk、6wk的主要炎症细胞。同时，肺纤维化、GM-CSFR和CCR2水平在CBDL 4wk、6wk显著增加，与M2巨噬细胞的变化高度一致。抗中性粒细胞抗体处理CBDL大鼠减少肺中性粒细胞和巨噬细胞聚集，氯磷酸盐脂质体或者联合应用抗GM-CSF抗体与MCP1抑制剂处理CBDL大鼠，减少巨噬细胞的肺内聚集，减轻肺纤维化和肺微血管扩张，缓解低氧血症。这些结果表明CBDL诱导的HPS大鼠模型中，早期肺内中性粒细胞的聚集介导了肺微血管扩张和低氧血症，后期GM-CSF/GM-CSFR 和MCP1/CCR2诱导的大量M2型巨噬细胞聚集，诱发肺纤维化，加重了肺微血管扩张和低氧血症，进而HPS形成，从而为临床HPS的治疗提供了理论依据。