DNA与RNA甲基化表观修饰对单倍体胚胎干细胞多能性与所产生个体发育能力的影响和作用机制研究

Haploid embryonic stem cells are important tools for genetic studies due to their advantages in studying the functions of recessive genes and ability to efficiently transmit genetic modifications to next generations. In 2012, the applicant and another research group of China have individually and successfully established mouse androgenic haploid embryonic stem cell lines, therefore made the application of haploid embryonic stem cells for gene functional studies in mammals feasible. However, the success rates of mammalian haploid embryonic stem cell establishment and healthy offspring production by fusing haploid embryonic stem cells with zygotes are still very low。Our previous work indicated that the aberrant expression of imprinted genes caused by abnormal DNA methylation is a major factor affecting the pluripotency level of haploid embryonic stem cells and the developmental ability of embryos produced by haploid embryonic stem cells. In this project, we will compare DNA and RNA methylation as well as gene expression status of mammalian haploid embryonic stem cells with different pluripotency levels as well as the embryos and animals they derived, to identify key regulatory factors involved in the regulation of the pluripotency level of haploid embryonic stem cells and the developmental ability of embryos produced by haploid embryonic stem cells through DNA or RNA methylation, to decipher the regulatory mechanisms of these key factors, to develop new methods that can increase the pluripotency level of haploid embryonic stem cells and improve the developmental ability of embryos produced by haploid embryonic stem cells, thus to establish high efficient platform for producing transgenic mammals using haploid embryonic stem cells.

单倍体胚胎干细胞系因其方便研究隐性基因的功能和可快速将基因修饰传递至后代的特性而成为遗传学研究中的重要工具。2012年申请人和我国另外一个研究团队分别成功建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系，使得在哺乳动物中利用单倍体胚胎干细胞研究基因功能成为可能。然而目前哺乳动物单倍体胚胎干细胞系建系及其与配子融合发育成健康个体的成功率还很低。我们的前期工作发现DNA甲基化差异造成的印记基因表达异常是影响单倍体胚胎干细胞系多能性及其后续发育能力的一个重要因素。本项目拟比较分析具有不同多能性水平的哺乳动物单倍体干细胞系及其产生胚胎与个体中的DNA与RNA甲基化修饰和基因表达差异，发现通过上述甲基化修饰影响单倍体胚胎干细胞系多能性水平与个体发育能力的关键调控因子并部分阐明其作用机制，开发通过调节上述因子提高单倍体胚胎干细胞系的多能性水平和后续发育能力的方法，建立基于单倍体胚胎干细胞的高效转基因哺乳动物制备平台。

单倍体细胞在进行隐性性状分析、遗传筛选和育种中具有重要的应用价值。在前期建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系，以及发现DNA甲基化差异造成的印记基因表达异常是影响单倍体胚胎干细胞系多能性及其后续发育能力的一个重要因素的工作基础上，本项目：1）利用单倍体胚胎干细胞系建立新型细胞系及生殖方式，包括：利用单倍体胚胎干细胞首次创造新型哺乳动物异种杂合二倍体胚胎干细胞；建立单倍体上胚层干细胞（EpiSC）；利用单倍体胚胎干细胞替代精、卵结合获得后代；对单倍体胚胎干细胞进行精确的印记修饰实现“同性”生殖。2）发现RNA甲基化表观修饰及细胞多能性的调控机制，包括：发现m6A RNA甲基化受到microRNAs的调节并促进多能性的重编程；发现m6A修饰作为mRNA新顺式元件调控外显子在剪接过程中被保留现象；阐明m6A修饰通过其结合蛋白YTHDC1调控mRNA选择性剪接的分子机制；发现普遍表达的基因通过选择性启动子参与干细胞多能性调控的新机制。这些成果将为进化生物学、发育生物学和遗传学等研究提供新的模型和工具；提出了研究印记基因的新的手段，并对重要的印记基因和印记区域进行了新的探索和发现；在解析m6A修饰形成的位点选择机制、拓展microRNA的新功能和发现新的细胞重编程调控因素方面均取得了开创性的重要突破。将有助于未来完成更多的生物学新发现。