DNA羟甲基化修饰对小鼠胚胎干细胞染色质结构与基因转录的影响

DNA methylation regulates chromatin structure and gene transcription, which in turn plays key roles in development and disease. 5-methylcytosine can be oxidized into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcystone by TET(ten-eleven translocation) family proteins. In addition to be an possible intermediate state during DNA demethyaltion, 5hmC has also been proposed to be a new epigenetic modification. Although we and other labs have recently revealed the genome-wide distribution principles of Tet1 and 5hmC in mouse embryonic stem cells, the detailed role of 5hmC in regulating chromatin structure and gene transcription remains largely unknown. Therefore, we plan to establish the Tet1/2 double knockout(DKO) ES cell line and investigate the differences in the chromatin structure and gene transcription between wild-type and Tet1/2-DKO ES cells by MeDIP-seq, ChIP-seq and RNA-seq techniques. The results will illustrate the epigenetic mechanism of TET proteins and 5hmC in the regulation of chromatin structure and gene transcription in mouse embryonic stem cells.

DNA甲基化影响染色质结构与功能,在发育与疾病中发挥重要作用。甲基胞嘧啶（5mC）可以被TET家族蛋白氧化成羟甲基胞嘧啶（5hmC）、甲酰胞嘧啶（5fC）及羧基胞嘧啶（5caC）。5hmC可能是5mC去甲基化的一种中间产物，同时也被认为是一种广泛存在的新型表观遗传修饰。最近我们课题组与国外其他几个实验室同时报道了小鼠胚胎干细胞中Tet1与5hmC的全基因组分布规律,但5hmC对染色质结构与功能的影响还不清楚。因此，我们计划构建Tet1/2基因双敲除的小鼠胚胎干细胞，采用MeDIP-seq（甲基化DNA免疫沉淀测序）、ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）及RNA-seq等技术检测野生型与Tet1/2双敲除小鼠胚胎干细胞在染色质结构与基因转录方面的差异。本项目的研究结果将阐明小鼠胚胎干细胞中TET蛋白及DNA羟甲基化修饰对染色质结构与基因转录的调控作用。

DNA 甲基化影响染色质的结构与功能，在发育与疾病发生过程中具有重要作用。2009年Tahiliani等人发现了TET蛋白可以催化5mC氧化成5hmC，2011年Xu与Zhang实验室同时发现TET蛋白还可以进一步催化5mC或5hmC氧化成5fC和5caC。5mC氧化生成的5hmC等氧化产物被认为是DNA去甲基化过程的中间产物，同时也被认为是新的表观遗传修饰。在本项目中，我们研究了TET蛋白介导的5hmC生成与DNA去甲基化对染色质结构与基因转录的影响。我们首先对野生型与Tet1/2基因双敲除的小鼠ES细胞进行了hMeDIP-seq、MeDIP-seq与ChIP-seq。我们发现Tet1/2基因双敲除不仅引起5hmC的全面丢失与5mC的部分获得，而且还导致发育分化相关基因启动子二价结构域（bivalent domain）的H3K27me3显著降低，提示Tet蛋白影响了染色质的组蛋白修饰。为了进一步阐明TET蛋白对染色质结构的作用机制，我们在293T细胞中成功过表达了TET2-WT（野生型）与TET2-Mut（酶活缺失突变体）。hMeDIP-qPCR与Sequenom MassARRAY显示在TET2-WT过表达细胞中高甲基化CpG岛发生了明显的DNA羟甲基化与去甲基化，而TET2-Mut过表达没有效应。ChIP-qPCR结果显示在TET2-WT过表达细胞中这些CpG岛同时生成了特异性的H3K4me3与H3K27me3富集峰，re-ChIP实验结果证实这些位置生成了全新的二价结构域。RT-qPCR检测结果发现这些原本沉默的基因在过表达TET2-WT而非TET2-Mut的293T细胞中转录激活。5-Aza-CdR处理293T细胞也具有TET2-WT过表达一致的效应，提示TET蛋白的作用主要依赖于DNA去甲基化而非新生成的5hmC。我们的研究结果首次揭示了TET蛋白介可以酶活依赖性重编程高甲基化CpG岛的组蛋白修饰，在这些位置建立全新的二价结构域，解除这些基因的转录沉默。我们的研究结果一方面揭示了TET蛋白调控两种重要表观遗传修饰（DNA与组蛋白甲基化）串话的新功能，另一方面也为肿瘤发生过程中TET蛋白与5hmC减少或丢失对抑癌基因启动子DNA高甲基化与关闭提供了全新的分子机制。