小鼠PGCs发育中Nanog基因表达的DNA甲基化调节对细胞多能性和迁移能力的影响研究

Mammalian primordial germ cells (PGCs), considered the gamete precursors, are segregated and specified from epiblast cells early in embryogenesis and migrate to genital ridges. Development of PGCs represents a unique process of cell fate specification that is intimately linked with epigenetic reprogramming. However, the roles of DNA demethylation in regulating the pluripotency and migration of PGCs remain elusive. This study aims to investigate the effect of DNA demethylation on cell pluripotency and migration regulation during PGC reprogramming. Firstly, PGCs at different developing stages with different migratory abilities will be isolated from mouse embryos by using flow cytometry, and an in vitro cell migration model will be established to observe cell migration. Secondly, the dynamic expression and epigenetic regulation of the pluripotency gene Nanog in PGCs will be studied. Finally, drugs affecting DNA methylation or targeting Nanog will be used to change the expression of Nanog, following which the expression of molecules associated with cell migration and mobility will also be studied. In a word, this study will elucidate the regulation mechanisms of DNA demethylation on Nanog expression, cell pluripotent and cell migration and migration-related molecule expression during PGC reprogramming.

哺乳动物原始生殖细胞（PGCs）从外胚层起源并迁移到生殖嵴的过程是一个独特的、与表观遗传重编程密不可分的细胞命运特化过程，DNA去甲基化在这一过程中起重要作用，有关DNA去甲基化与PGCs细胞多能性和迁移活性的相关性及作用途径还有待研究。本研究拟对PGCs发生过程中DNA去甲基化重编程与细胞属性的相关作用开展研究，利用流式细胞技术分离不同发育阶段、具有不同迁移能力的PGCs，通过建立体外细胞迁移模型，针对多能性相关基因Nanog，研究其在PGCs重编程中的表达和调节的动态变化，同时结合影响DNA甲基化或影响Nanog表达的药物处理改变Nanog转录表达，观察细胞多能性及细胞运动相关分子表达的变化，阐明PGCs重编程中DNA去甲基化调节Nanog基因的机制和协同作用方式，及Nanog对PGCs多能性维持和迁移能力调节的分子机制的作用，为配子发生机制及对受精的作用研究提供新思路。

PGCs是生殖细胞的前体细胞，目前对其细胞多能性和迁移活性的相关性及作用途径还有待研究。本课题完成了以下研究内容：.1） PGCs的分离和鉴定。免疫荧光检测显示SSEA-1和OCT-4定位于E10.5胚胎的背肠系膜，SSEA-1定位于E13.5胚胎的生殖嵴。利用流式细胞术分选E10.5和E13.5胚胎细胞，分选后细胞的AKP阳性率均为90%左右。实时荧光定量PCR显示，分选后的细胞中PGCs标记基因Fkbp6、Mov10L1、4930432K21Riken、Spo11的表达均显著高于SSEA-1阴性细胞（P<0.001），E13.5的分选细胞中的多能性基因Nanog、Oct4和生殖细胞特异性基因Mvh、Dazl的mRNA丰度均显著高于E10.5的细胞（P<0.001）。.2） PGCs细胞的培养方法。利用不同饲养层（MEF和STO）和基底膜基质（Matrix）的培养系统对获得的PGCs细胞进行初步培养。结果表明，PGCs在Matrix中更容易产生集落，且集落均表现出AKP阳性和OCT4阳性，较早胚胎时期的PGCs更容易形成集落，将早期PGCs在Matrix体系中培养，有助于其多能性的维持。.3） 小鼠PGCs迁移过程中的基因表达及表观遗传修饰。分析MMPs和TIMPs在E10.5和E13.5期PGCs中的表达和定位，结果表明，MMP/TIMP在E10.5和E13.5 PGCs中动态调节，MT1-MMP的高表达可能促进了PGCs从发生部位定向迁移到生殖嵴；DNA甲基化水平检测表明MMP/TIMP分子的表达与其基因调节区DNA甲基化相关，在E13.5 PGCs中Timp3的低甲基化导致其表达上调。.4）小鼠原始生殖细胞在迁移和分化阶段的单细胞转录组分析。利用hiseq4000测序平台结合PE101测序方法对经流式获得E9.5和E12.5的mPGCs（分别对应迁移中和到达生殖嵴）进行单细胞表达谱测序分析，共获得13,977个转录本，其中 9,822 个属已知蛋白编码基因，1,048个未注释。为阐明mPGCs迁移过程中的调控网络，进行了表达基因通路。结果表明，测序所获得的DEGs中有75个通路在(KEGG数据库中被注释（P＜0.01）。进一步分析表明ErbBs信号通路在mPGCs迁移过程中具有重要作用。