泛素化修饰对小分子RNA介导的DNA甲基化影响的研究

DNA encodes the genetic information in the cell, DNA is usually packaged into a higher order structure termed chromatin (DNA+histones). Chromatin undergoes several kinds of epigenetic modifications adding extra information affecting the expression of underlying sequences. One of the most relevant modification is DNA methylation; which is an epigenetic mark essential for several biological processes such as gene and transposon silencing, imprinting. More recently there is increasing evidence of DNA methylation being involved in the regulation of gene expression in response to changing environment.. One of the most prominent pathways in the establishment and maintenance of DNA methylation is the RNA-directed DNA methylation (RdDM) pathway, whose ultimate effector is the enzyme DOMAINS REARRANGED METHYLASE 2 (DRM2). Recently, two genes, SNF2-RING-HELICASE–LIKE1 and -2 (FRG1 and -2) were found to be involved in the RdDM pathway. In addition, FRG1 physically associates with the SU(VAR)3-9-like histone methyltransferase SUVR2 in vivo. Precise function and biochemical mechanisms of action FRGs and SUVR2 still needs to be elucidated. In this proposal I hypothesize that FRG-SUVR complex could play a role in recruiting DRM2 to the chromatin.

DNA是细胞内携带遗传信息的主要分子物质。在真核生物中，DNA分子以染色质的形式和组蛋白高度凝聚复合存在。因此，细胞对染色质上DNA和组蛋白成分的化学修饰提供了除DNA分子序列以外的又一层信息，及表观遗传调控效应。DNA分子的甲基化作为最主要的表观遗传调控方式，参与调控包括基因表达，转座子活性，遗传印记，X染色体的抑制等诸多生物学反应。. 植物中的甲基化依据其生成的机制可分为复制保持型和重新合成型。DNA甲基化的重新合成通过一个叫做“小分子RNA介导的DNA甲基化”途径完成。DRM2是此途径的核心甲基化酶。我们的工作发现，两个新基因FRG1和FRG2也参与这个途径的下游反应，并且与组蛋白甲基化酶家族SUVR2直接互作。在这里我们将探索FRG-SUVR复合体如何调控DRM2在染色质上的定位。

我们发现了两个功能冗余蛋白,FRG1和FRG2(SNF2-RING-HELICASE–LIKE1 and -2)，是属于解旋样蛋白SNF2家族的染色质修饰蛋白。全基因组甲基化测序分析表明FRG1和FRG2的同时缺失会导致特定RdDM靶向位点的甲基化缺陷。我们的研究表明，在体内，FRG1与一种已知的RdDM成分SUVR2存在物理关联。因此，我们的结果确定了FRG1和FRG2是RdDM机制中新的成分。.组蛋白变体H2A.Z存在于所有已知的真核生物中，并涉及多种功能，包括基因表达、DNA复制、DNA损伤修复和同源重组等。另外,H2A.Z在植物响应环境变化调节基因表达重编程的过程中也起着重要的作用。SWI2/SNF2相关的染色质重塑复合体(SWR1-C)负责将H2A.Z沉积到核小体中。然而，拟南芥SWR1-C的组成成分尚不清楚。我们以SWR1-C的保守亚基ARP6（ACTIN-RELATED PROTEIN 6）蛋白作为诱饵，通过免疫共沉淀耦联质谱分析纯化了拟南芥SWR1复合体的成分。我们不仅分离出9种已知的成分，也鉴定出一些新的与组蛋白乙酰化和染色质生物学相关的相互作用蛋白。我们首先研究了MBD9与ARP6相互作用的生物学意义和分子机制。通过生化、遗传和转录组分析，我们证实了在拟南芥中MBD9与SWR1复合体相互作用，且MBD9是在ARP6依赖的基因中沉积H2A.Z所必需的。我们对mbd9-3和arp6-1突变体之间的遗传相互作用的分析表明，尽管双突变体有更严重的发育表型，但在开花时间上，ARP6对MBD9是表观上位的。通过ChIP_Seq和RNA_Seq，我们也发现了一部分基因，它们的表达和在它们的基因组位点上沉积H2A.Z都需要ARP6和MBD9，这表明这两种蛋白在某些情况下存在一定的功能冗余性。免疫共沉淀耦联质谱分析证实了MBD9与ISWI(Imitation SWItch)染色质重塑复合体存在强烈的相互作用，这也表明MBD9蛋白还存在其它的功能。ChIP-seq分析表明MBD9定位于活跃基因的核小体缺失区域。而ATAC_Seq实验表明MBD9并不影响开放染色质本身。综上所述，我们的研究证实了MBD9是SWR1复合体相互作用蛋白，是在活跃转录基因中沉积H2A. Z所必需的。