T淋巴细胞KCa3.1钾通道在静脉血栓栓塞症发病中的作用及机制

Venous thromboembolism (VTE) is a serious life-threatening disease. In recent years, the interaction of inflammatory cytokines、damaged endothelial and leukocyte triggers inflammatory cascade and promotes venous thrombosis, but the mechanism remains still not clear. Our group has recently reported that immune dysfunction of T lymphocytes triggers thrombus formation in veins, whole human genome microarray and Gene Ontology (GO) analysis suggested that the expression of KCa3.1 in peripheral blood T cells was elevated. KCa3.1 plays an important role in T cell activation, and acts as a new drug target with attractive prospect for immune regulation. Therefore, we presume that the elevated KCa3.1 expression is a key step in the venous thrombosis, which may lead to VTE though endothelial activation by T cells. In the current study, we sought to apply animal models and use specific KCa3.1 blockers or activators in vivo to explore the target role of KCa3.1 in VTE. Further we sought to apply co-culture method to test the affect KCa3.1 of T cell on endothelial cell function, and explore the potential mechanisms through endothelial activation on venous thrombosis. This investigation will provide new insights from ion channels aspect into the pathogenesis and the therapeutic as well as prevention strategies for VTE.

静脉血栓栓塞症（VTE）是一种严重的威胁生命的疾病。研究报道炎症因子、血管内皮损伤与白细胞相互作用触发炎症系列瀑布反应，促进静脉血栓形成，但其作用机制较少被研究。本课题组发表多篇文章报道T淋巴细胞免疫功能异常参与静脉血栓形成，应用全人类基因组芯片研究发现VTE患者T细胞KCa3.1钾通道表达升高，而KCa3.1在T细胞活化中起重要作用，是免疫调节新的药物靶点。因此我们假设KCa3.1高表达是VTE发生的关键环节，可能通过T细胞激活与内皮细胞作用导致VTE。本研究采用动物模型，在体应用特异性KCa3.1阻断剂或激活剂观察对深静脉血栓形成影响，探索KCa3.1在VTE发病中的靶位作用。并应用细胞共培养的方法，验证T细胞KCa3.1对内皮细胞功能的影响，探索其介导内皮细胞激活促进静脉血栓形成机制。本研究从细胞离子通道角度为VTE发病机制的探索及新的药物防治靶点的研究提供实验依据。

目的 探索T细胞KCa3.1钾通道在VTE形成中的靶位作用。方法 选取SD大鼠，随机分为深静脉血栓组、KCa3.1阻断剂喂养组、KCa3.1激活剂喂养组、假手术。WB法和PCR法检测外周血T淋巴细胞 KCa3.1通道蛋白表达。在体应用通道阻断剂和激活剂，观察各组静脉血栓的形成比例，血栓长度、重量，光镜、电镜下血栓的病理变化，并采用免疫组化法、WB法和PCR法检测各组静脉管壁多种细胞的通道表达情况。体外实验应用T细胞和脐静脉内皮细胞共培养，观察阻断或激活该钾通道后内皮细胞分泌组织因子和细胞因子的改变以及NF-κB表达，探讨KCa3.1干预静脉血栓形成的机制。结果 1、与 C 组相比，DVT组大鼠外周血T淋巴细胞该通道蛋白和 mRNA 的水平均明显上调。2、与DVT组相比，DB组大鼠静脉血栓严重程度较轻，表现为血栓长度和重量明显减轻，光镜下显示内膜增厚程度减轻，淋巴细胞减少，电镜下显示内皮细胞损伤程度较轻;同时DB组该通道免疫组化阳性染色减少，静脉 T 淋巴细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中该通道蛋白和mRNA水平均明显下调;DV组大鼠静脉血栓严重程度较重，同时DV组KCa3.1通道免疫组化阳性染色增多，静脉T淋巴细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中KCa3.1通道蛋白和mRNA水平均明显上调。3、Control组为T细胞和脐静脉内皮细胞共培养组，Control+TRAM-34和Control+TRAM-34+PDTC组的KCa3.1 和NF-κB P65蛋白表达量显著低于对照组，Control+SKA-31和Control+SKA-31+PDTC的KCa3.1和NF-κB蛋白表达量显著高于对照组。TRAM-34处理内皮细胞后分泌组织因子和细胞因子含量明显下降，SKA-31处理后内皮细胞分泌组织因子和细胞因子高于对照组。结论 1、VTE大鼠T淋巴细胞中KCa3.1表达显著上调，且编码基因KCNN4的转录水平较假手术组显著上调，揭示了KCa3.1通道与VTE的发生、发展密切相关。2、通过在体应用KCa3.1通道特异性阻断剂及激活剂，发现KCa3.1通道高表达能促进 VTE的形成，而阻断该通道后能显著抑制VTE的发生发展，验证了KCa3.1通道在VTE形成中的靶位作用。3、NF-κB是KCa3.1激活内皮细胞重要的信号途径。