草鱼HMGB2b蛋白对GCRV感染免疫应答的动态互作分子及机理解析

High mobility group box (HMGB) gene family are non-histone chromatin proteins, functioning as universal sentinels in antiviral immune responses in mammals. However, little is known about the relevant functions in special members in fish. Applicant finds that that grass carp HMGB2b can inhibit propagation of grass carp reovirus (GCRV) and its subcellular localizations are changed post GCRV infection, specially and remarkably. In the present proposal, CiHMGB2b-tag fusion cell lines are constructed and infected by GCRV. Isolates and identifies interaction proteins by protein co-immunoprecipitation and LC-MS/MS techniques. The potential interaction proteins are verified by bimolecular fluorescence complementation and reverse co-immunoprecipitation techniques. At last, CiHMGB2b and interaction molecules model molecular docking. Clarifying the interaction proteins and nucleic acids of CiHMGB2b and the interaction mechanisms in nucleus and cytoplasm. These researches will not only clarify characteristics and functions of piscine HMGB2b in antiviral immune responses, but also serve the systematic clarification on the functions and mechanisms of piscine HMGBs in immune network.

高迁移率族蛋白B（HMGB）家族是一类非组蛋白染色质蛋白，在哺乳动物抗病毒免疫应答中具有必不可少的“前哨”作用，然而具有鱼类特色成员的免疫功能机制还不清楚。申请者发现草鱼HMGB2b抑制GCRV增殖，且特异性地对GCRV表现出强烈的亚细胞迁移。在此基础上，本项目建立草鱼HMGB2b融合标签表达细胞系，GCRV感染，蛋白质免疫共沉淀技术分离互作蛋白，通过LC-MS/MS进行鉴定，双分子荧光互补及反向免疫共沉淀验证。然后，进行模拟分子对接分析。揭示其在细胞核和细胞质的互作分子及机理。本研究不仅将阐明具有鱼类自身特点的新型受体HMGB2b在抗病毒免疫应答中的作用和地位，而且为系统阐释鱼类HMGB家族在免疫调控网络中的功能和机制打开突破口。

高迁移率族蛋白B（HMGB）家族是一类非组蛋白染色质蛋白，在哺乳动物抗病毒免疫应答中具有必不可少的“前哨”作用，然而具有鱼类特色成员的免疫功能机制还不清楚。我们前期研究发现草鱼HMGB1a/1b、HMGB2b对GCRV感染及微生物相关分子模式(poly(I:C)、LPS)刺激表现出强烈的核质迁移。本研究构建了这3个成员的标签融合表达载体，转染草鱼肾细胞系（CIK），G418筛选，获得稳转细胞系，GCRV感染，利用蛋白质免疫共沉淀技术分离互作蛋白，通过LC-MS/MS结合鱼类蛋白库、草鱼转录组数据库进行比对鉴定互作蛋白。HMGB1a互作蛋白多含有coiled coil结构域，免疫相关的有CARD9、TGFβ等。HMGB1b互作蛋白有HSP70、HSP90等。HMGB2b互作蛋白多为细胞骨架、ATP等相关蛋白，与免疫相关蛋白有HCF C1、N4BP1等。通过构建互作蛋白的标签载体，与相应的HMGB成员共转染，进行反向免疫共沉淀，结果表明GCRV感染后只有HMGB1b与HSP70的互作关系得以确定，进一步研究表明GCRV感染通过诱导活性氧的产生使HSP70部分进入细胞核，在细胞核中HSP70与HMGB1b发生互作，诱导HMGB1b从细胞核部分迁移至细胞质，在细胞质中HMGB1b与HSP70发生不互作；在细胞质中，HMGB1b和HSP70都与Beclin 1互作，促进自噬。自噬的发生反过来抑制GCRV的增殖。本研究揭示了HMGB1b在GCRV诱导自噬的机制中作用，对病毒诱导自噬发生机制的研究具有重要意义。对于HMGB下游的RIG-I样受体家族及Toll样受体19的调控机制也开展了探索性研究，取得了如下结果：MDA5和RIG-I通过调控IRF3/7的磷酸化和二聚化发挥抗病毒功能，MDA5发挥着比RIG-I强大的功能，研究结果可以部分的解释为何部分动物基因组没有RIG-I依然发挥着正常的抗病毒能力；LGP2在静息状态及GCRV感染早期负调控RIG-I和MDA5介导的抗病毒免疫应答，对LGP2的调控机制给出了明确界定；TLR19在早期内体识别dsRNA通过TRIF接头分子激活干扰素途径和NF-κB途径发挥免疫应答，TLR19是鱼类特有的Toll样受体之一，是第三个识别dsRNA的Toll样受体。这些研究初步探讨了HMGB介导的免疫调控网络。