番茄DDB1与ATR激酶互作参与基础免疫应答的分子机理研究

UV-Damaged DNA Binding Protein 1 (DDB1) plays critical roles in various cellular progressions in plant. Our research group found that DDB1 in tomato was involved in the basal defense response; however, the mechanism is largely unknown. We have observed that DDB1 transports into nuclear from cytoplasm upon the infection of Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 (Pst DC3000) on tomato seedlings. Results indicated that phosphorylation might occur to DDB1 in the process of shuttling, and ATR kinase was involved in the regulation of DDB1 shuttling. However, the mechanism of this regulation remains unclear. This proposal aims to define the mechanism of DDB1 involving defense response mediated by ATR using tomato as model. This research contains identification of the role of phosphorulation on DDB1 shuttling, detection of the reaction between ATR and DDB1, and determination of the role of DDB1 shuttling on tomato defense response. These results would contribute to understand the mechanism of DDB1 involving in plant defense response, and provide new theoretical and technical clues to transgenic breeding programs to enhance crop resistance against biotic stress.

紫外损伤DNA结合蛋白1（UV-Damaged DNA Binding Protein 1, DDB1）参与调控植物多种重要的生理活动过程。本课题组前期研究发现，DDB1在番茄的基础防御应答中起正调控作用，但其作用的机制尚不明确。申请人用Pst DC3000侵染番茄幼苗时观察到细胞质中的DDB1蛋白向细胞核穿梭的现象。初步试验结果表明，DDB1在进入细胞核过程中可能发生了磷酸化修饰，且蛋白激酶ATR参与调控DDB1的穿梭，但其分子机理还不清楚。本研究拟利用番茄为模式生物，开展ATR调控DDB1参与番茄基础防御应答的分子机制研究，研究内容包括磷酸化修饰对DDB1穿梭的影响、ATR蛋白与DDB1的相互作用、以及DDB1的穿梭在番茄抗病中的功能。研究结果将有助于阐明DDB1参与植物防御应答的分子机理，为培育农作物抗病新品种提供新的理论依据和技术途径。

番茄DDB1蛋白参与调控多种重要的生理活动过程，并且在番茄的基础防御应答中起正调控作用。本项目主要开展了以下几个方的研究工作：.（1）以番茄为研究材料，研究了番茄DDB1突变体材料hp1、DDB1过表达DDB1-OE、番茄野生型AC+对Pst DC3000的抗性，发现DDB1-OE的抗性最强，AC+次之，hp1最感病。DDB1-OE中的抗病信号分子H2O2累积量以及细胞凋亡显著高于AC+和hp1，hp1中H2O2累积量和细胞凋亡量最低；DDB1的抗病作用与SA信号有关，Pst DC3000处理后，DDB1-OE和AC+中SA含量均受到诱导，hp1中SA含量未受到显著诱导，与下游Marker基因表达量一致。这表明，DDB1通过调控SA信号通路起抗病作用，且DDB1在 SA上游起作用。.（2）在Pst DC3000侵染条件下，细胞质中的DDB1向细胞核迁移，为验证DDB1的细胞核迁移是否为DDB1发挥抗病作用的充分条件，观察亚细胞定位发现，DDB1311N→Y定位于细胞核，这个结果表明，DDB1蛋白311位天冬氨基酸突变为赖氨酸后，DDB1的亚细胞定位发生变化，而且，DDB1的细胞核迁移不是DDB1抗病功能的充分条件。DDB1向细胞核的迁移与SA有关，SA处理后，番茄细胞中质中的DDB1像细胞核迁移，而H2O2处理后，也观察到同样的结果，而SA和H2O2均能引起细胞核中DNA的损伤，DDB1向细胞核的迁移是DNA损伤直接导致的结果。Pst DC3000侵染条件下，细胞中SA和H2O2含量升高，引起DNA损伤，ATR蛋白将信号转导给细胞质中的DDB1，DDB1穿梭到细胞核中，修复DNA，调控抗病相关基因的表达，增强番茄抗病性。ATR与DDB1不能直接发生相互作用，二者之间，有其它蛋白起信号传递作用。.（3）为研究DDB1与MAPK信号通路是否有关，在Pst DC3000侵染条件下，检测了DDB1-OE、AC+和hp1中几个MAPK基因表达量的变化，发现在DDB1-OE中，ANP3、MKK2、MPK3和MPK6的表达受到显著诱导，而在hp1中，这几个MAPK基因的表达量几乎没有受到诱导，表明DDB1对番茄抗病性的调控作用依赖MAPK信号通路。同时发现在真菌模式分子衍生物壳聚糖的诱导下，番茄中也产生了相似的免疫应答，表明DDB1在番茄PTI免疫应答途径中起调控作用。