基于骨髓应急造血的脓毒症后胸腺“反跳性增生”的机制研究

Severe sepsis could induce thymic atrophy, and subsequently lead to a decrease of T lymphocytes and secondary adaptive immune deficiency. Supported by National Natural Science Foundation, we have explored the molecular mechanisms involved in severe sepsis-induced thymic atrophy. Strikingly, we observed a rebound thymic hyperplasia in septic mice models. According to the preliminary results, we hypothesized that there are two important aspects of factors may be involved in thymic hyperplasia: 1) intrinsic negative factors in hematopoietic stem/progenitor cells must be relieved; 2) existence of positive factor in thymic microenvironment to promote thymocyte development. To test this hypothesis, we intend to use mouse model of sepsis to investigate kinetic changes in the numbers and function of hematopoietic stem cells and lymphoid progenitor cells; to explore the intrinsic negative regulators for lymphoid commitment, differentiation and migration of bone marrow hematopoietic stem cells and lymphoid cells by using gene expression profiling analysis, in vitro OP9-DL1 cells co-culture and in vivo competitive hematopoietic reconstruction; to investigate the changes in the thymic microenvironment that promote thymocyte development by assessing IL-7, IL-22 levels and their downstream signaling pathways. We expect to clarify the mechanism of "rebound thymic hyperplasia" after sepsis from the view of emergency hematopoiesis.

重症脓毒症导致胸腺萎缩,是造成适应性免疫缺陷的重要因素。在前期国自然支持下，申请人从“应急造血”角度阐述了重症脓毒症导致胸腺萎缩的分子机制，并且发现脓毒症模型小鼠胸腺在萎缩后可发生“反跳性增生”这一重要现象。根据前期结果，申请人提出：胸腺反跳性增生需要同时具备两个条件： 1）造血干、祖细胞内部抑制T淋巴细胞生成的因素被解除；2）胸腺造血微环境中促进T淋巴细胞生成的因素增强。申请人拟采用脓毒症模型小鼠，探讨骨髓和胸腺中造血干、祖细胞数目与胸腺增生的关系；采用表达谱系分析、体外OP9-DL1细胞共培养、体内竞争性干、祖细胞移植等方法，从造血干、祖细胞定向分化和迁移能力角度探讨导致胸腺萎缩的因素是否解除；从IL-7、IL-22促进胸腺细胞发育的信号通路入手，探讨胸腺微环境中促进胸腺细胞分化发育的因素，从应急造血角度阐明胸腺反跳性增生的机制，为寻找促进脓毒症患者免疫功能恢复的治疗方法提供新思路。

重症脓毒症导致胸腺萎缩，是造成适应性免疫缺陷的重要因素。在前期发现脓毒症模型小鼠胸腺在萎缩后可发生“反跳性增生”这一重要现象的基础上，本研究采用盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠模型，研究骨髓、胸腺和脾脏免疫细胞的动态变化，发现：1）CLP术后4 T细胞发育各个阶段（DN、DP、SP）细胞数量均明显恢复，说明胸腺体积增大是由于胸腺免疫细胞明显增多引起的；2）从CLP术后4周小鼠骨髓长期造血干细胞（LT-HSC）显著增加，短期造血干细胞（ST-HSC）显著降低；多潜能祖细胞（MPP）明显增加，胸腺中早期T淋巴祖细胞ETPs的细胞比例并没有明显的变化，但是造血干、祖细胞分化相关基因谱系逐渐恢复正常。3）细胞测序这一新技术分析揭示，脓毒症在细胞数目上主要影响了胸腺DP细胞TCR重排阶段（rearrangement）的细胞群体以及选择阶段（selection）两个群体，在DPblast 阶段，基因表达已经发生显著变化，提示有可能DPblast的功能改变，造成下游细胞群体细胞数量和功能的改变；4）假时间序列分析发现胸腺细胞分化路径发生改变，脓毒症4周后CD4和CD8 SP群体的分化路径以及脾脏T淋巴细胞功能，并未完全恢复正常。提示胸腺变化对成熟T细胞可能发生影响，而且时间持续长久。综上所述，本课题证实了脓毒症通过影响骨髓应急造血功能，导致胸腺反跳性增生；阐述了导致“胸腺反跳性增生”的造血细胞内在因素和胸腺微环境外部因素，明确了脓毒症造成胸腺萎缩的细胞靶点；证实胸腺“反跳性”增生后仍存在分化功能障碍，并影响外周T细胞功能，为促进脓毒症患者免疫功能恢复的提供了新靶点。