PP2Ac Y284位点硝基化在肾小管管周毛细血管内皮细胞转分化中的作用及其机制研究

肾小管管周内皮细胞向间充质转分化（EndoMT）是新近发现的肾间质肌成纤维细胞的重要来源，其发生机制与内皮细胞紧密连接失去功能密切相关。申请者既往的研究表明：炎症因素可以激活内皮细胞蛋白丝/苏氨酸磷酸酶2A（PP2A），使紧密连接封闭蛋白（Occludin）丝/苏氨酸位点去磷酸化，从而参与内皮细胞紧密连接的功能调控。近年来有研究表明：PP2A催化亚单位C（PP2Ac）Y284位点的硝基化可激活PP2Ac，但是此机制是否参与EndoMT以及进行性肾间质纤维化的发生发展目前还不十分清楚。本研究在申请者前期的工作基础上，拟应用可穿透性底物模仿多肽、基因点突变、小鼠尾静脉液压法等技术，从细胞、动物和临床标本三个层面探讨PP2Ac Y284位点硝基化对紧密连接功能的调控作用和EndoMT发生发展的分子机制，为探索防治肾间质纤维化进行性发展的新的治疗靶点和策略提供实验依据。

肾小管管周内皮细胞向间充质转分化（EndoMT）是新近发现的肾间质肌成纤维细胞的重要来源，其发生机制与内皮细胞紧密连接失去功能密切相关。研究表明蛋白丝/苏氨酸磷酸酶 2A（PP2A）的催化亚单位 C（PP2Ac）酪氨酸位点硝基化可激活 PP2A并能下调紧密连接连接蛋白（Occludin）丝/苏氨酸位点磷酸化，从而参与内皮细胞紧密连接的功能调控。本研究探讨PP2Ac酪氨酸核心位点硝基化对内皮细胞紧密连接的影响，并阐明该位点是肾小管管周毛细血管EndoMT的重要调控分子，参与进行性肾间质纤维化,为探索防治肾间质纤维化进行性发展的新的治疗靶点和策略提供实验依据。本研究首先在原发性和继发性肾脏疾病中证实EndoMT的发生。继而，体外构建硝基化反应体系，用Peroxynitrite刺激重组的PP2Ac蛋白，western blotting收集对照组和刺激组中的蛋白行质谱检测，分析PP2Ac酪氨酸发生硝基化的具体位点有Y284/267/265/218/130/127。对上述硝基化位点进行计算机模拟分析，发现PP2Ac Y127在蛋白质空间结构、相邻氨基酸电荷分布上具有更稳定的空间表位优势，因此确定Y127位点在PP2Ac活化过程中起核心作用。进而，围绕PP2Ac Y127位点设计、构建、合成底物模拟多肽和对照多肽。在细胞实验中证实可穿透性底物模仿多肽可竞争性抑制TGF-β1诱导的酪氨酸位点的硝基化，保护紧密连接功能，进而抑制EndoMT发生，发挥抗纤维化的作用。动物实验中，首先应用活体成像技术检测多肽在小鼠体内的分布以及代谢状态，发现多肽在肝脏和肾脏中具有较高的药物积聚，其半衰期为3小时；然后通过尾静脉联合腹腔多肽注射观察多肽对UUO小鼠肾脏纤维化的干预效应，结果提示较对照多肽，底物模拟多肽可明显抑制Occludin去磷酸化， 减少EndoMT发生，稳定外周毛细血管结构并减轻肾间质纤维化。总之，PP2Ac Y127是调控EndoMT的关键位点，应用改为点的底物模仿多肽在体内外均能抑制内皮细胞转分化，可有效干预肾间质纤维化，是肾间质纤维化治疗的潜在生物靶点。