肾小管上皮细胞自噬与间充质转分化相互作用的分子机制及其在肾脏纤维化中的意义

Autophagy and epithelial-mesenchymal transition (EMT) occur in renal epithelial cells after sublethal injury. However, the interaction and regulation of these two events and the role in renal fibrosis are largely unknown. Our preliminary data showed that inhibition of autophagy can accelerate the process of renal fibrosis. Epithelial cells G1/S arrest resulted in autophagy, whereas G2/M arrest led to EMT. Impairment of autophagy in epithelial cells increased the expression of profibrotic cytokines and promoted fibroblast proliferation and extracellular matrix accumulation. In this proposal, we will first examin if the reduction of autophagy by mTOR inhibitor or epithelial cells-specific deletion of autophagy related 5 (Atg5) is associated with renal fibrosis in mice unilatreral ureteral obstruction (UUO) and 5/6 nephrectomy. We will further explore the interaction between autophagy and EMT by downregulating Atg5/Smad3 with siRNA in HK2 cells, and the role of mTOR signal pathway in regulating autophagy and EMT both in vitro and in vivo. Finally, we will prospectively investigate correlation between autophagy and pathology and clinical outcome in chronic kidney disease. Our study will provide a scientific basis and new target site for prevention and treatment of renal fibrosis.

肾小管上皮细胞的损伤可触发自噬和间充质转分化（EMT）。但这两者之间的关系、调控机制和在肾脏纤维化中的意义不清楚。我们前期研究表明肾小管上皮细胞自噬和EMT的诱导呈细胞周期依赖性，G1/S停滞的细胞表现为自噬，G2/M期则为EMT，且抑制自噬可增加炎症因子释放，促进肾脏纤维化，提示调控自噬与EMT的关系可延缓纤维化的进程。本项目拟应用下调肾脏mTOR活性促进自噬和特异性敲除肾小管上皮细胞Atg5致自噬缺陷的小鼠慢性肾脏病模型，进一步证实抑制肾小管上皮细胞自噬可加速肾脏纤维化；沉默HK2细胞Atg5/Smad3，明确自噬和EMT转换的关系；通过体内外实验阐明mTOR通过调控细胞周期介导自噬和EMT的机制及对肾脏纤维化的影响；前瞻性观察自噬与慢性肾脏病临床及病理的相关性。本研究有助于揭示肾小管上皮细胞自噬与EMT的关系和调控机制，以及自噬调控纤维化的信号通路，为临床防治肾脏纤维化提供科学依据。

研究表明，在肾脏组织损伤修复的过程中，修复不完全的肾小管上皮细胞停滞于细胞周期G2/M期，可合成和分泌大量致纤维化的细胞因子，引起肾脏纤维化。细胞自噬具有细胞保护的功能，但是，其在肾间质纤维化中的作用和调控机制，目前尚不清楚。因此，本项目研究的主要内容包括：①分别利用雷帕霉素下调小鼠肾脏mTOR活性促进自噬，以及条件性特异性敲除小鼠肾小管上皮细胞Atg5基因（Atg5-/-）造成自噬缺陷，建立小鼠梗阻性肾病模型（UUO），明确肾小管上皮细胞自噬在肾脏纤维化发生发展中的作用。②应用羟基脲和诺考达唑分别诱导肾小管上皮细胞停滞于G1/S和G2/M期，Ang II刺激细胞，研究自噬对细胞周期及胶原沉积的影响；采用高表达/沉默/变异肾小管上皮细胞Atg5，以及提取Atg5-/-小鼠原代肾小管上皮细胞，探讨细胞自噬与细胞周期的关系，揭示肾小管上皮细胞自噬延缓肾脏纤维化的分子机制。 . 我们的结果发现：①小鼠UUO肾间质纤维化模型中，肾小管上皮细胞自噬先于 Col I 蛋白水平和肾脏纤维化的发生。雷帕霉素增强自噬，能显著延缓和改善 UUO 诱导的小鼠肾间质纤维化；特异性敲除近端小管上皮细胞自噬相关基因 Atg5，使自噬功能缺陷，则加剧肾间质纤维化程度。但是，雷帕霉素不能增强Atg5-/-小鼠肾小管上皮细胞的自噬水平，不能改善UUO-介导的Atg5-/-小鼠的肾间质纤维化。②在野生型 Atg5 的 UUO 模型中，随着自噬高峰的减弱和纤维化加重，停滞于 G2/M 的小管上皮细胞增加。肾小管上皮细胞特异性 Atg5 敲除的 UUO 小鼠，阻滞于G2/M 的小管上皮细胞显著增加，肾脏纤维化程度更重。③在体外实验中，AngII 刺激HK2细胞，处于G1/S期的细胞主要发生自噬， G2/M期细胞COL1蛋白表达水平增加。应用Agt5 siRNA下调HK2细胞Atg5蛋白水平，可增加G2/M期阻滞和COL1的蛋白表达；而高表达Atg5，则减少AngII诱导的G2/M期阻滞和COL1的蛋白表达；但高表达Atg5基因突变株（K130R）则不能逆转G2/M期阻滞。从而揭示，Atg5 通过自噬依赖作用抑制肾小管皮细胞G2/M期阻滞，进而减轻UUO所致肾间质纤维化。. 本研究初步阐明了肾小管上皮细胞自噬在肾脏纤维化中的作用及其调控机制，为丰富肾脏纤维化的发病机制