苜蓿中华根瘤菌LysR家族转录因子LsrB的作用机制研究

LysR家族转录因子是在细菌中广泛分布的一类调节蛋白，它们中的很多成员能够调节细菌与宿主植物之间的相互作用。我们前期的研究鉴定了一个新的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LysR家族调节基因lsrB，发现它是共生固氮作用所必需的。该基因的插入突变体只能诱导紫花苜蓿形成大量的低效固氮根瘤，宿主植物生长矮小。我们推测LsrB调节了特定的共生固氮相关基因的表达。为了验证这个推测，本项目拟应用转录组学与染色质免疫共沉淀技术，系统地鉴定LsrB调节的下游基因，并通过实时定量RT-PCR验证获得的结果；对于表达量显著变化的新的靶基因，将通过基因缺失来研究其生物学功能；再通过启动子融合和凝胶滞后进一步确定LsrB调节蛋白与功能靶基因启动子之间的相互作用，从而揭示LsrB调节共生固氮作用的分子机制。本项目对于进一步阐明共生固氮的分子机理，提高共生固氮作用的效率具有重要意义。

LysR 家族转录因子是在细菌中广泛分布的一类调节蛋白,它们中的很多成员能够调节细菌与宿主植物之间的相互作用。我们前期的研究鉴定了一个新的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LysR家族调节基因 lsrB,发现它是共生固氮作用所必需的。该基因的插入突变体只能诱导紫花苜蓿形成大量的低效固氮根瘤,宿主植物生长矮小。我们推测 LsrB 调节了特定的共生固氮相关基因的表达。为了验证这个推测,本项目主要开展了如下研究：1）LsrB下游靶标基因的分离鉴定；2）LsrB关键靶标基因的生物功能分析；3）LsrB蛋白调节下游基因表达的分子机制。应用自杀型质粒pK18mobsacB成功构建了苜蓿中华根瘤菌lsrB的缺失突变体，接种宿主植物紫花苜蓿，形成低效固氮根瘤；通过根瘤切片，显微镜观察发现这些无效根瘤处于不同程度的衰老状态，固氮类菌体的分化受阻，而且大量类菌体已经被降解。转录组学的研究显示，在lsrB突变体中谷胱甘肽（GSH）和脂多糖（LPS）核心寡糖合成相关的相关的基因（gshA、gshB1、lrp3和lpsCDE 等）明显下调。与此一致的是lsrB突变体合成较少的LPS和GSH。已有研究结果显示苜蓿中华根瘤菌1021的gshA失活突变体无法诱导紫花苜蓿形成根瘤，而gshB1和lpsCDE突变体则形成早衰固氮根瘤，与我们在lsrB突变体上取得研究结果相一致。我们进一步在大肠杆菌中表达纯化了LsrB蛋白，制备了多克隆抗体，进行免疫印迹实验发现lsrB缺失突变体确实不表达LsrB蛋白。染色质免疫共沉淀(ChIP)显示该蛋白可以与lrp3-lpsCDE操纵子的启动子区直接结合，而凝胶阻滞实验（EMSA）也证明LsrB 蛋白可以在体外直接与lrp3-lpsCDE操纵子的启动子区的TN11A元件结合。综合现有的研究结果，可以确定LsrB通过调节脂多糖和谷胱甘肽的生物合成，控制根瘤菌细胞的氧化还原状态，从而影响共生固氮作用。通过本项目的实施，使我们认识到LsrB是根瘤菌感受氧化胁迫的主调节蛋白，它也是根瘤菌-豆科植物共生互作后期的关键调节蛋白。在本项目的资助下，我们已经发表标注本项目资助的SCI论文5篇（其中Applied & Environmental Microbiology 2篇），申请国际发明专利1项，国家发明专利3项，毕业研究生1名。