苜蓿中华根瘤菌NtrY/NtrX双组份系统的作用机制研究

Several two-component regulatory systems from rhizobia are required for symbiotic nitrogen fixation on on host plants. The two-component system of NtrY/NtrX was firstly identified in Azorhizobium caulinodans, is essential for symbiotic nodulation and nitrogen fixation. However, the molecular mechanism of this two-component system is not clear. Our work indicates that Sinorhizobium meliloti NtrY/NtrX system also regulates the exopolysaccharide production,flagellum formation and cell differentiation. Therefore, this system is versatile. The two possible mechanisms are suggested as following: 1) the histidine kinase NtrY phosphorylates several noncognate response regulators; 2) the response regulator NtrX directly regulates many downstream targeted genes. To test these possibilitites, proteins interacting with NtrY will be screened using phosphorylation profiling, in combination of bacterial two-hybrid and immunoprecipitation. On the other hand, the targeted genes of NtrX will be systemically identified using transcriptomic and chromatin-immunoprecipitation (ChIP) technologies, which will be confirmed by Real-Time RT-PCR, promoter-GUS fusions and the electrophoretic motility shift assay (EMSA). Last, the roles of newly identified genes in symbiotic nitrogen fixation will be studied by constructing null mutants. This project is important for us to exploit the molecular regulation of symbiotic nitrogen fixation and the mechanism of fidelity and plasticity of two-component systems.

双组份系统是根瘤菌进行共生固氮作用的主要调节系统。NtrY/NtrX双组份系统最早发现于田菁根瘤菌,是结瘤、固氮所必需的。但其作用机制并不清楚。我们的研究发现，该系统还调节苜蓿中华根瘤菌胞外多糖合成、运动以及细胞分化，具有多功能性。其可能的分子机制有两种：1）NtrY组氨酸激酶同时磷酸化多种反应调节蛋白；2）NtrX反应调节蛋白同时激活多个下游靶标基因表达。为了检验这两种可能性，本项目拟应用磷酸化谱技术，结合细菌双杂交和免疫共沉淀，分离鉴定可以被NtrY直接磷酸化的蛋白质；应用转录组学与染色质免疫共沉淀技术，鉴定NtrX直接调节的下游靶标基因，并通过实时定量RT-PCR、启动子融合以及凝胶阻滞技术，验证获得的结果，从而揭示NtrY/NtrX双组份系统多功能性的分子机制。本项目对于阐明共生固氮作用的分子机制以及揭示细菌双组份系统信号传递保真性及可塑性具有重要的理论意义。

双组份系统主要由组氨酸激酶和反应调节蛋白组成，是根瘤菌进行共生固氮作用的主要调节系统（如FixL/FixJ和DctB/DctD等）。NtrY/NtrX双组份系统最早发现于田菁根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）,是结瘤固氮所必需的。但其作用机制并不清楚。在本项目中，我们应用遗传学和生物化学方法系统地研究了模式根瘤菌——苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）NtrY/NtrX双组分系统的功能及其作用机制。通过创制ntrY基因的缺失突变体和ntrX基因的下调（knock-down）突变体，并考察其遗传表型，发现NtrX可以广泛地调节多种细胞生理过程，包括胞外多糖I（EPSI，琥珀酰聚糖， succinoglycan）的生物合成、鞭毛的合成及运动、生长和共生结瘤固氮，具有多功能性；且其自身不可缺失，其蛋白分子上的磷酸化位点（D53）不可替换； NtrY不是NtrX上游唯一的组氨酸受体激酶，因为其缺失突变体在实验条件下不影响上述细胞生理过程。应用各种组学技术（包括RNAseq和ChIPseq等）发现NtrX作为转录因子直接调节超过1600个下游基因的表达，包括胞外多糖合成酶基因(exo)、鞭毛蛋白及其调节基因（fla）、细胞周期有关基因（div）和氨基酸代谢基因（gln）等。据此，我们建立了一个新的NtrY/NtrX磷酸级联传递系统控制细菌生理过程的工作模型：NtrY与其它组氨酸激酶分子感受环境信号，自身磷酸化，再将磷酸基团转移给NtrX，磷酸化的NtrX直接调节下游基因（包括多个转录因子）的表达，从而控制多种细胞生理过程和行为。我们的研究首次揭示了NtrX反应调节蛋白多功能性的分子机制。本研究的价值：1）改变了我们对于固氮细菌双组份调节系统信号传递保真性的认识。以前一直认为调节共生固氮作用的双组份系统其组氨酸激酶和反应调节蛋白存在一一对应关系，所以信号传导是高保真的。但是，我们的研究结果显示一个反应调节蛋白可以对应多个组氨酸激酶即二者之间存在多对一的关系，信号传导是动态可塑的。2）提出了新的科学问题，即在共生固氮系统中，类菌体感受宿主营养信号和控制细胞周期运行的协调机制问题。