苜蓿中华根瘤LsrB调节3-磷酸甘油代谢的机制研究

The Rhizobium-legume symbiotic nitrogen fixation supplies main combined nitrogen for ecosystem. LysR family transcriptional factors from Rhizoubium play essential roles in nodulation on host plants. In our previous work, we found that a Sinorhizobum melilotit LysR family regulator, LsrB, could suppress alfalfa nodule premature-senescence. In order to seek the key downstream genes directly regulated by LsrB and responsible for legume nodules development, we identified about 400 genes differential expression in lsrB mutants by a transcriptomic (RNA-seq) method. Among them, most of genes involved in glycerol-3-phosphate (G3P) metabolism were significantly down-regulated in the mutants. Therefore, we propose that LsrB regulates glycerol-3-phosphate (G3P) metabolism contributing to alfalfa nodule development. To test the possibility, this project will analyze the genes expression of glycerol-3-phosphate metabolism by using qRT-PCR and promoter-reporter gene fusion, and LsrB-promoter DNA interactions through EMSA and ChIP assays. Last, roles of those genes involved in glycerol-3-phosphate metabolism will be studied by constructing loss of function mutants of the genes and analyzing their phenotypes on nodulation and nitrogen fixation. The project is important for elucidating molecular mechanism of late-stage nodule development.

根瘤菌与豆科植物之间的共生体系为自然生态系统提供了主要的化合态氮。在豆科植物固氮根瘤形成过程中，根瘤菌LysR家族调节因子起着关键的调节作用。我们前期的研究发现，苜蓿中华根瘤菌的LysR家族转录因子LsrB能抑制宿主紫花苜蓿固氮根瘤早衰。为寻找LsrB直接调节的对根瘤衰老起决定作用的下游基因，我们应用转录组学（RNA-seq）技术筛选到400多个基因在lsrB突变中差异表达，其中3-磷酸甘油代谢（G3P）相关的基因下调最为明显。因此，我们推测LsrB蛋白可能通过调节3-磷酸甘油代谢影响根瘤发育。为验证该假设，本项目拟应用qRT-PCR和启动子-报告基因融合技术来研究G3P代谢相关基因的表达；运用EMSA和ChIP技术确定LsrB是否直接调节这些基因的表达；最后，通过突变体构建以及表型分析等实验研究它们在结瘤固氮过程中的作用。该项目的实施对揭示后期根瘤发育的调控机理具有重要理论意义。

根癌农杆菌通过IV型分泌系统（T4SS）将T-DNA从Ti质粒转移至宿主植物，侵染双子叶植物并形成冠瘿瘤。这个过程受植物分泌物和细菌调节因子的调节。我们发现，苜蓿中华根瘤菌LysR家族转录调节蛋白（LsrB）能够调节其与寄主植物紫花苜蓿共生作用。然而，在根癌A.tumefaciens中尚未见关于其同源蛋白的报道。本研究发现，根癌农杆菌A.tumefaciens的LsrB蛋白是宿主植物高效转化所必需的。根癌农杆菌A.tumefaciens的lsrB缺失突变体在琥珀聚糖的产生、农杆菌对根的吸附能力，抗氧化应激以及对铁利用限制等诸多方面表现出缺陷。RNA-Seq测序分析表明，该突变体与野生型菌株相比，有465个基因的表达存在显著差异（162个基因上调，303个基因下调），包括琥珀糖生产、铁转运蛋白和氧化应激解毒酶。此外，苜蓿中华根瘤菌、布鲁氏杆菌或根癌农杆菌的lsrB基因均能回复苜蓿中华根瘤菌或根癌农杆菌lsrB缺失突变体的缺陷。因此，我们的研究结果提示，LsrB的功能在根瘤菌科共生菌和致病菌中是非常保守的。