差异miRNA在子痫前期胎盘组织中的表达和功能研究

子痫前期(PE)是人类妊娠期特有疾病，严重威胁母婴健康，其发病机理至今不明，胎盘滋养细胞功能障碍是PE发病的病理基础。新近研究表明，miRNA可在人胎盘中特异表达，其特有的基因调控功能可能与PE发病密切相关。我们前期研究发现：miRNA在PE与正常胎盘中的表达存在很大差异，通过miRNA靶基因预测，初步筛选出了与PE发病相关的miRNA(miR-152,18a,30a-3p)，由此推测miRNA可能在维持妊娠过程中发挥重要作用，其表达失衡可能参与了PE发病过程。本项目拟在前期研究基础上，应用Northern blot、荧光实时PCR、原位杂交等方法进一步筛选和验证正常与PE胎盘中差异表达的miRNA；采用过表达和特异性抑制技术"干预"胎盘滋养细胞中miRNA的表达，检测其对靶基因表达的调控效应及对滋养细胞增殖、凋亡、浸润功能的影响。以期进一步阐明PE发病的分子机制，为提高其诊疗水平提供依据

1. 选取10个miRNA，应用Real-time RT-PCR进行验证，其中8个miRNA与芯片结果相符：miR-210、miR-152与miR-518b在sPE胎盘中表达升高（P<0.05），miR-377、miR-411、miR-542-3p、miR-18a与miR-363在sPE胎盘中表达下降（P<0.05）；2. 通过TargetScan与PITA预测系统对靶基因预测发现：在miR-30a-3p、miR-152与miR-18a的可能的作用靶点中，分别包括IGF1、HLA-G与ESR1等与PE发病相关的基因；3. 细胞浸润结果提示过表达mir-10b后，实验组细胞的侵袭率显著性升高（P<0.05）；4. 应用六种靶基因预测软件证实miR-18a与其靶基因ERα之间的靶向调控关系。血浆激素水平检测显示正常孕妇组血浆中雌二醇水平明显高于子痫前期孕妇组（P<0.05）；免疫组织化学检测结果显示两组胎盘组织中均有ERα阳性表达，子痫前期组ERα在细胞滋养细胞的细胞质内或细胞核内的阳性表达率高于正常孕妇组（P < 0.05）。RT-PCR结果显示正常孕妇组和子痫前期孕妇组均有ERα表达，对比显示子痫前期组ERα表达高于正常孕妇组（P < 0.05）。Western-blot结果显示ERα在蛋白水平的表达子痫前期组高于正常孕妇组（P < 0.05）.5. 在JEG-3细胞中过表达与抑制miR-18a后，RT-PCR结果显示转染后JEG-3细胞中miR-18a的表达受调控后升高和降低显著；ERα mrna水平表达在转染前后差异显著（P < 0.05），受miR-18a负性调控显著；Western-blot结果显示ERα在蛋白水平的表达也受到miR-18a的负性调控。 6. 流式细胞技术检测结果显示，过表达与抑制miR-18a后，各实验组与对照组比较细胞的增殖能力无明显差异(P＞0.05 )；降调节miR-18a的表达可明显增加细胞的凋亡率（P < 0.05）；细胞浸润实验发现，降调节miR-18a的表达可明显降低JEG-3 细胞的侵袭能力（P < 0.05）。 7. 流式细胞术结果发现，miR-30a-3p过表达与抑制后，各实验组与对照组在细胞周期中增殖能力方面无差异（P ＞0.05）；凋亡结果显示过表达miR-30a-3p组可明显增加滋养细胞凋亡率（P ＜0.05）。