miRNA-101调控内质网蛋白ERp44在子痫前期胎盘滋养细胞凋亡作用中的研究

子痫前期（PE）系多因素所致的以高血压、蛋白尿为主要表现的妊娠特发疾病。国内外研究表明"氧化应激－内质网应激－细胞凋亡"是其重要发病机制。我们前期研究结果显示PE胎盘滋养细胞中，内质网蛋白ERp44 6倍显著高表达，伴随内质网凋亡通路激活， 而miRNA-101显著下调，生物信息学分析发现miRNA-101与ERp44存在结合位点，基于以上结果提出"miRNA-101-ERp44-内质网应激-滋养细胞凋亡-PE"调控假设。拟采用荧光素酶报告基因技术验证miRNA-101与ERp44靶向关系；在人原代滋养细胞水平，研究miRNA-101调控ERp44介导内质网应激、滋养细胞凋亡机制，在体水平进一步验证此机制。本课题以miRNA-101对ERp44转录后调控为切入点，以ERp44介导胎盘滋养细胞内质网应激、细胞凋亡为核心，从转录后调控水平完善PE发病机理，为PE防治提供理论依据。

内质网应激所致的滋养细胞凋亡是揭示PE发病机制的重要线索之一，本课题组前期采用蛋白质组学方法研究发现，子痫前期胎盘中ERp44近6倍显著高表达。有报道证实miRNAs在PE胎盘组织中显著性差异表达，并且课题组前期检测了已有报道的PE胎盘组织中下调的23条miRNAs，发现miRNA-101等表达下调，并通过生物信息学分析得出，miR-101与ERp44基因3’UTR区有7个连续碱基配对，因而miRNA-101可能通过与ERp44 mRNA特异性的碱基配对参与靶基因的转录后调控。基于ERp44的显著高表达、miRNA的低表达、及二者之间的联系，我们提出假设：具有高危因素的孕妇，在多种内外环境影响下，胎盘滋养细胞miRNA-101下调，使ERp44显著性高表达，加重内质网应激，进而导致胎盘滋养细胞凋亡，PE发生。.本研究通过（1）定量PCR检测PE胎盘组织中miR-101表达，结合ERp44蛋白表达结果分析发现二者存在显著负相关，Pearson相关系数=-0.826；（2）采用荧光素酶报告基因技术验证二者靶向关系，荧光抑制率大于30%，证明二者存在靶向结合；（3）在人滋养细胞细胞HTR-8/SVneo中验证二者靶向关系：合成成熟的miRNA-101 mimics序列（5’- UACAGUACUGUGAUAACUGAAG-3’），同时合成针对其的特异性的反义寡核苷酸，转染HTR-8/SVneo细胞，检测ERp44蛋白表达发现，与各自对照组相比，过表达miRNA-101组ERp44表达受抑制，而封闭miRNA-101组ERp44表达显著升高；（4）在HTR-8/SVneo中采用Western blotting、流式细胞技术等分子生物学方法证实 miRNA-101调控ERp44在子痫前期胎盘滋养细胞内质网凋亡途径中的作用：干预miR-101表达后，检测细胞凋亡改变及内质网应激相关蛋白（PERK、ATF6 、CHOP /GADD153、Caspase12）的表达，发现过表达miRNA-101组滋养细胞凋亡数量显著降低，且内质网应激通路四个蛋白表达显著受抑制；而封闭miR-101组结果相反。以上结果从细胞水平证实了我们提出的假说，从miRNA 和内质网应激的角度完善并丰富了子痫前期发病机理，为PE的发病提供了一定的理论依据并为PE的防治提供了新的研究靶点。