PPAR-γ激活对局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元自噬的调控研究

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)是一类配体激活型核转录因子，参与了体内多种病理生理过程。新近发现，PPAR-γ激活调控肿瘤细胞自噬。然而，其对脑缺血再灌注损伤后自噬的调控尚未清楚。我们的前期研究及既往资料表明，PPAR-γ激活对脑缺血再灌注损伤起保护作用，而脑缺血再灌注损伤后自噬的激活对神经元具有损伤作用，推测PPAR-γ激活抑制脑缺血再灌注损伤后神经元自噬。因而，本课题拟建立小鼠脑缺血再灌注模型和原代神经元缺氧缺糖/复氧复糖模型，通过透射电镜、免疫荧光、免疫印迹等方法研究自噬溶酶体活性的变化，阐明PPAR-γ激活对脑缺血再灌注损伤后神经元自噬的调控作用；利用体外细胞模型，通过免疫印迹法研究自噬信号通路蛋白的表达变化，进一步阐明PPAR-γ激活调控脑缺血再灌注损伤后神经元自噬的分子机理，以期为探寻防治脑缺血灌注损伤的新靶点

目的：探讨PPAR-γ激动剂15d-PGJ2对脑缺血再灌注损伤后神经元自噬的调控作用及其分子机制。方法：建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型和原代神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型。利用透射电镜观察神经元中自噬溶酶体的激活，Western Blot和免疫荧光法检测体内和体外缺血再灌注损伤后神经元自噬相关蛋白表达变化，以及PPAR-γ激动剂15d-PGJ2对这些蛋白表达的影响。结果：⑴ 透射电镜显示，脑缺血再灌注损伤后神经元胞浆自噬小体形成，线粒体肿胀。Western Blot结果显示，再灌注损伤6h、12h及24h后缺血皮层自噬溶酶体相关蛋白LC3-II、Beclin 1、cathespin B和LAMP1表达明显增高， 12h达到高峰。侧脑室注射3-甲基腺嘌呤（3-MA）60μg能显著降低缺血再灌注损伤24h后缺血皮层的LC3-II水平，减少脑梗死面积，并减轻神经行为学损伤。侧脑室注射15d-PGJ2（1、10、50pg），再灌注12h后缺血皮层的自噬溶酶体相关蛋白LC3-II、Beclin、cathepsin B和LAMP1表达明显下降，呈剂量依赖关系。免疫荧光显示脑缺血再灌注6h及12h后神经元中LC3和cathespin B表达强度明显高于假手术组。15d-PGJ2（50pg）处理，再灌注12h后神经元中LC3和cathepsin B表达强度亦显著减弱。⑵ OGD/R损伤6h、12h及24h后神经元LC3-II、Beclin 1表达明显增高，而p62表达持续下降。15d-PGJ2（0.5、1μM）显著降低LC3-II和Beclin1表达水平，而p62表达增加。15d-PGJ2（0.5、1μM）预处理后神经元细胞活性明显增加，LDH漏出率明显降低。⑶ OGD/R后Bcl-2表达水平逐渐增高，呈时间依赖关系，而Beclin 1表达逐渐下降。15d-PGJ2（1μM）预处理显著增加OGD/R 24h后Bcl-2表达，而降低Beclin 1表达。利用Bcl-2 siRNA或scRNA转染神经元细胞，建立OGD2/R24模型，Bcl-2 siRNA可取消15d-PGJ2的抑制效应，自噬蛋白Beclin 1和LC3-II表达恢复。结论：脑缺血再灌注损伤后15d-PGJ2抑制神经元自噬参与其保护效应，15d-PGJ2通过上调Bcl-2蛋白表达从而抑制自噬。