磁珠法和量子点标记筛选及验证双歧杆菌的粘附蛋白

双歧杆菌具有调节肠道微生态平衡、抑制致病菌的侵入、抗肿瘤、抗突变和抗衰老等重要生理作用。双歧杆菌粘附和定植肠黏膜上皮细胞的强弱不仅是其发挥益生作用的前提，也是评价其作为潜在微生态制剂的首选指标。目前研究双歧杆菌粘附的难点集中在介导双歧杆菌与肠道细胞相互作用的粘附蛋白上。本研究拟借助偶联肠上皮细胞碎片的磁珠，筛选出双歧杆菌的粘附蛋白。克隆表达筛选到的粘附蛋白，创新性引入量子点技术验证蛋白的粘附功能，同时结合ELISA等方法检测该粘附蛋白的其他生物学功能，如抑制致病菌的粘附，对细胞因子的影响等。本研究将蛋白质技术、细胞培养与分子免疫方法相结合，是对研究益生菌和肠上皮细胞相互作用的一种思路创新，也是为建立原核生物的细胞表面成分和真核细胞的表面受体相互作用的研究模式的一种探索。本研究成果将有助于建立益生菌菌株的粘附蛋白筛选平台，挖掘具有黏附和免疫作用的益生菌的物质基础。

现代微生物学领域的核心研究方向之一是研究微生物与宿主的相互作用。双歧杆菌是研究细菌与肠道相互作用的模式菌，其在调节肠道微生态平衡、抑制致病菌侵入、抗肿瘤、抗突变和抗衰老等方面具有重要的生理作用。粘附肠黏膜上皮细胞的强弱不仅是双歧杆菌发挥生理作用的前提，也是评价其作为潜在微生态制剂的首选指标。目前，学术界一致认为双歧杆菌的粘附是由胞壁中脂磷壁酸、肽聚糖及细菌表面粘附蛋白等粘附素参与或介导的与宿主细胞表面受体相结合的过程，其中表面蛋白在粘附和免疫过程中扮演着重要的角色，然而相关的研究报道和文献资料较少。. 本研究从双歧杆菌粘附出发，磁性纳米材料为载体，创新性地利用磁珠偶联肠上皮细胞碎片，分离了长双歧杆菌中参与粘附肠上皮细胞的粘附蛋白。通过质谱测序得到其中四条的肽段序列，生物信息学分析后，获得完整的蛋白序列和基因序列。对这四个粘附蛋白分别克隆表达后，用量子点标记，证实其中三个蛋白具有粘附功能。其中蛋白PP1和PP2都能抑制大肠杆菌O157：H7，单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌对肠上皮细胞的粘附，此外荧光定量检测发现能降低肠上皮细胞的JNK和p38蛋白的转录水平。蛋白PP1通过ELISA检测发现能增强IL4、IL8和TNF TNF-α的产生。另外采用同样的方法从动物双歧中分离筛选到两条粘附蛋白，并通过质谱测序得到完整蛋白和基因的序列。. 另外表达了可能的粘附蛋白-BIF，采用量子点标记技术标记后，在荧光显微镜下直接观测到其与肠上皮细胞HT-29、T-84的粘附。验证了BIF对单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157：H7具有明显的粘附抑制作用。此外用BIF蛋白刺激肠上皮细胞发现，可促进肠上皮细胞产生IL-4和IL-8，但对TNF-α的产生没有影响。用BIF的多抗筛选到四株产类BIF蛋白的菌株。其中三个蛋白用量子点标记后验证能与肠上皮细胞HT-29粘附，但来源B. lactis WLABO9的类BIF蛋白未发现其粘附功能。.综上所述，发现和研究益生菌的粘附基因和蛋白，填补细胞和分子水平上研究益生菌与致病菌的相互作用的空白，不仅在微生态学领域的基础理论研究中具有创新性，而且对于开辟新的功能蛋白资源，提升我国微生态制剂研究在国际上的水平和地位，具有一定的推动作用。.