应用启动子陷阱技术研究酸面团中乳酸菌的风味相关基因

When involved in the sourdough fermentation, lactic acid bacteria (LAB) initiate different metabolic pathways and produce special flavor substances and functional ingredients due to the impact of dough matrix and fermentation conditions. Up to date, molecular mechanism of interaction between lactic acid bacteria and sourdough is rarely reported, reuslting in its being the one of the hot and difficult point in studying traditional fermented food. To ascertain the molecular modeling of special metabolic behavior of lactic acid bacteria in sourdough fermentation, we plan to improve the promoter trap technology to screen out the inducing expression gene of LAB in sour dough , overcoming the shortcomings of the interference of the constitutive promoter and loss of down-regulated genes. Moreover, we screen out the genes related to flavor substances metabolism, and disclose the theoritical basis for optimization the sour dough processing, strain breeding and raw material controlling, according to the effect of physical and chemical factors on gene regulation expression. Since the biotechnology level of Chinese traditional cereal fermentation is backward, this project will provide foundation for cereal further processing. It will also provide research models and new ideas for the study of the interaction between microbiology and traditional fermented food matrix.

受面团基质和发酵条件等因素的影响，乳酸菌参与面团发酵时，启动不同的代谢途径，产生特殊的风味物质和功能性成分，从而使酸面团和面制品具有独特的品质和风味。乳酸菌与酸面团相互作用的分子机理研究目前鲜见报道，成为研究传统发酵食品的难点和关键问题之一。为确定面团中乳酸菌特殊代谢行为的分子作用背景，本项目拟改进启动子陷阱技术，克服组成型启动子干扰和不能筛选下调表达基因的缺点，筛选乳酸菌在面团中被诱导表达的基因，进而从中筛选与风味物质代谢相关的基因；通过研究影响这些基因调控表达的理化因素，为面团发酵工艺优化、菌种选育及原料控制等提供理论依据。我国传统谷类食品发酵的生物技术水平较为落后，本项目将为粮食深加工提供技术基础，也为微生物与食品基质(属传统发酵食品)的相互作用研究提供研究模式和新的思路。

我国传统面食发酵剂的应用历史悠久，种类繁多，其复杂的微生物群系使得传统发酵面食风味独特，深受广大消费者的青睐。迄今，有关我国不同地域的酸面团菌群对比分析研究较少，缺乏菌株与风味物质形成相关性的系统研究。为此，本文以我国不同地区传统发酵酸面团为研究对象，系统考察了酸面团中菌群多样性，并对其分离菌株的生物学功能进行了评价，对乳酸菌在面团发酵过程中的性能及代谢产物进行了分析，旨在为传统面食发酵剂的基础研究提供参考。高通量测序结果表明，山东、山西、甘肃和青海四个地区的酸面团样品之间细菌菌群差异较大，其中山东地区的酸面团菌群最为丰富，共鉴定到274种细菌，其中特有的菌种达到128种，远多于其他地区酸面团的数量。此外，来源于青海的两个不同基质（青稞和荞麦）的酸面团中的菌群具有较高相似性，表明酸面团中的细菌菌群具有地域性。.结合传统分离法和16S rDNA基因测序从山东酸面团中分离获得13株乳酸菌，共鉴定出8种菌，为深入挖掘酸面团发酵剂中的乳酸菌资源，采用单菌发酵实验对上述13株菌的发酵性能进行了分析。结果发现，乳酸菌发酵能使酸面团获得较为适宜的酸度，大幅度增加酸面团中的游离氨基酸种类和含量，尤其是必需氨基酸。瑞士乳杆菌D01产脯氨酸、谷氨酸，嗜酸乳杆菌D02产精氨酸的能力较强。.在构建了启动子陷阱文库和转录组测序的基础上，发现有许多酸面团发酵过程中涉及风味的相关基因，并通过荧光定量检验，选择了其中4个基因进行克隆表达，并对二磷酸尿核苷-N乙酰胞壁酸丙氨酸-谷氨酸连接酶和乳清酸磷酸核糖转移酶这两个基因进行western blotting，证明这两个基因参与风味的形成。 .综上所述，本文对4个地区的传统酸面团中的菌群结构、菌株生物学功能进行了系统剖析，利用启动子陷阱和转录组测序筛选验证了风味相关基因，并为更大范围地筛选安全及良好性能的酸面团发酵菌株提供了方法和依据。