DUX4-IGH融合蛋白诱导急性B淋巴细胞白血病的发病机制研究

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood leukemia, of which B acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is most prevalent form (~80%). Very recently, a novel DUX4-IGH oncogenic fusion has been reported in 7% in B-ALL patients. However, until now, very little structural and molecular information is available for DUX family, and it is not clear how DUX4-IGHs bind DNA to regulate downstream target genes to trigger B-ALL leukemgenesis. In our preliminary research, we have determined the crystal structure of HD2 domain of DUX4. Point mutations can abolish or significantly impair the DNA binding activity of DUX4-HD2. More importantly, the perturbations in the binding interfaces of DUX4-IGH preclude the transactivating activities of DUX4-IGH on transcription/expression of ERGalt, a leukemogenic ERG isofrom in B-ALL. Using RNA-seq technology, we have identified some direct DUX4-IGH target genes abnormally overexpressed in DUX4-driven B-ALL, and thought to play important role in the transformation of B lymphoid precursors. In this proposal, we propose to employ a multidisciplinary approach combining the technologies such as structural biology, cellular and molecular biology, and the animal model to 1）clarify the transactivational basis of DUX4-IGH-driven B-ALL leukemogenisis; 2) search/design/improve the novel therapeutic intervention specifically targeting the interaction DUX4:DNA in B-precursor acute lymphoblastic leukemia.

急性淋巴细胞白血病是最常见的儿童白血病，其中急性B淋巴细胞白血病的比例占80%。最近发现一种新融合基因，DUX4-IGH，在B-ALL中约占7%。迄今为止，DUX家族的分子、结构信息知之甚少，DUX4-IGH如何结合DNA、调控下游靶基因进而引发B-ALL的发生机制亦尚不清楚。在前期研究中，我们解析出DUX4的HD2结构域的晶体结构。初步功能研究表明，干扰DUX4-IGH与DNA的结合可以抑制DUX4-IGH下游靶基因ERGalt的转录激活和高表达。与此同时，我们通过对B-ALL病人RNA-seq数据的分析，找到了一些可能受DUX4-IGH调控而异常高表达的基因，提示它们在B-ALL发病中也起着重要的作用。本项目研究目标是，利用结构生物学手段，结合细胞和分子生物学、小鼠建模等技术，阐明DUX4-IGH在白血病发病中的作用机制，寻找、设计和优化可以应用在临床上的小分子靶向药和化疗方案。

DUX4（Doublehomeobox4）是一种转录因子，编码两个串联的同源结构域。研究发现，DUX4与IGH重排形成的DUX4/IGH融合基因在B-ALL发病中起重要推动作用。DUX4/IGH融合出现在7%的B-ALL病人中，并且伴随着ERGalt异常高表达。ERGalt可诱导Arf-/-基因敲除小鼠发淋巴细胞白血病。因此，ERGalt被认为是DUX4/IGH驱动的白血病发生中的二次打击事件。在本课题中，我们确定了DUX4HD2单体和DUX4HD2-DNAERG复合物晶体结构，并以结构为基础验证了DUX4/IGH的DNA结合能力对B-ALL的发生产生重要影响。蛋白结构与功能验证共同揭示了双同源盒基因DUX4和ERG之间的两步结合机制，并且同源盒结构域HD1、HD2以及C末端结构域在DUX4/IGH识别下游靶基因中都是必需的。HD1和HD2的大沟结合界面中的单突变可显著破坏DUX4与ERG结合以及随后的转录激活。在B细胞分化实验中，基于结构的突变也显著破坏了DUX4/IGH的转录活性及其对B细胞分化的抑制作用。经系统分析DUX4和DUX4/IGH下游靶基因结合原件的特征，发现DUX4和DUX4/IGH偏好于结合TGATXXXATTA反应原件。为了更加深入地揭示该类型白血病的发病机制，我们通过解析DUX41-150-ERG的复合物结构（2.8Å）以及溶液状态下的小角衍射（SAXS）实验，观察到一个通过HD1和HD2亚基间柔性的linker区域介导的同时与两个DNA交联的DUX41-150二聚体构象。在随后的B细胞分化实验中，以基于结构的HD1-HD2 linker区域为靶点而非DNA结合能力的突变会显著损害DUX4/IGH导致ERGalt的生物发生及其致癌活性。通过shRNA敲低RAG1/2实验，我们发现即使DUX4/IGH仍旧高表达，但ERGalt的生物发生也会被抑制。基于结构设计的哺乳动物细胞双杂交实验和免疫共沉淀(Co-IP)实验表明，DUX4/IGH与DNA复合物通过交联构象将RAG1/2募集到DRE-DRE位点，进而催化白血病中的V(D)J-like的切割/重组和致癌剪接，是其下游靶基因异常转录本产生的原因。这些结果有助于确定一种以前未被认识的致癌交联机制以及一个全新的潜在的药物靶向位点。