整合素激活c-Src的机制及其在血栓中的应用研究

The integrin β3-mediated c-Src priming and activation, via the SH3 domain, is consistently associated with diseases such as the formation of thrombosis and the migration of tumor cells. Conventionally, activation of c-Src is often induced by the binding of proline-rich sequences to its SH3 domain. Instead, integrin β3 utilizes R760GT762 for priming and activation. Due to the lack of structural information, it is not clear where RGT will bind to SH3, and under what mechanism this interaction can prime/activate c-Src. Recently, we reported a 2.0 ? X-ray crystal structure in which SH3 is complexed with the RGT peptide. Functional characteriazation showed that mutations in the "N"-Src loop (i.e. the binding site) will disrupt the interaction between the RGT peptide and SH3 domain. This has led to the hypothesis of a novel non-canonical c-Src activation mechanism. More importantly, the crystal structure of SH3:RGT complex has laid out the foundation that could lead to the discovery/design of small molecules targeting the thrombosis and cancer mestatasis. In this proposal, we propose to use the tools of structura biology, the zebrafish model and other biochemical assays to 1) furhter clarify the activation mechanism of c-Src by integin β3; 2) design and test the small molecules in the content of c-Src:β3 ineraction and platelet aggregation.

Integrin介导的c-Src活化和血栓的形成、肿瘤细胞的迁移相关联。一般情况下，c-Src由其SH3结构域和富含脯氨酸的蛋白序列结合而活化。Integrin利用其胞内C末端的RGT来激活c-Src。由于结构数据的缺失，RGT如何结合SH3，又如何激活c-Src，是有待于解决的问题。最近，我们报道了分辨率达2.0埃的SH3:RGT复合物晶体结构（Xiao et al, Blood, 2012）。结构显示，RGT结合在SH3的"N"-Src loop。体内外的功能实验表明，"N"-Src loop的突变，将影响RGT和SH3的结合以及integrin介导的c-Src活化。我们提出了新的非经典的c-Src的活化机制模型。本计划书的研究目标是，利用结构生物学手段，并结合斑马鱼模型，进一步阐明integin激活c-Src的调控机制，同时寻找和设计可以应用在临床上的小分子靶向药物。

整合素介导的c-Src活化与血栓的形成、肿瘤细胞的迁移密切相关。c-Src通常由其SH3结构域和富含脯氨酸的蛋白序列的结合而活化。整合素β3亚基利用其胞内C末端的RGT来激活c-Src。由于结构数据的缺失，RGT如何结合SH3，又如何激活c-Src，是有待于解决的问题。基于我们已解析的SH3:RGT复合物晶体结构(Xiao et al, Blood, 2013)，我们提出新的非经典的c-Src的活化机制模型，RGT结合位点处于SH3的“N”-Src loop上。在本项目中，我们进一步证明整合素β3和c-Src之间相互作用关系与它们的结构密切相关，RGT与SH3的结合打破了原有三者之间作用力的平衡，启动了c-Src活化的第一步。该发现对研发针对血栓和抑制肿瘤细胞迁移的新型药物有重要指导作用。结构信息提示RGT多肽中R的侧链非常重要，我们对多肽RGT中的R氨基酸进行改造，并检测改造后的多肽对c-Src的SH3功能域相互作用及对c-Src酶活性的影响。结果发现，Arg突变成Lys可以明显增强药物与SH3的结合，提示Arg的长链和其柔软度可能是日后药物改造的方向。我们正通过晶体衍射学获得c-Src与RGT衍生物的复合物结构，进一步巩固我们的Src激活理论基础和进一步循环优化药物。.同时，在血液病靶点蛋白和感染性疾病相关蛋白的结构生物学研究中，我们成功解析了白血病靶点蛋白PML-RARα的四聚体三维结构(Wang et al, Nature Communication, 2017)，为白血病治疗和预后提供新的结构生物学理论基础；成功获得单个SafD以及三个连续亚基SafDAA的高分辨率蛋白结构(Zeng et al, eLife, 2017)，证明细菌通过胞间粘附分子寡聚促进生物被膜形成是一种普遍现象，为沙门氏菌防治提供精细的靶点蛋白结构视野，为当今全球抗生素耐药加剧问题的解决提供崭新的思路。