基于Eppin蛋白质结构的避孕分子设计

Epididymal protease inhibitor (Eppin) is a perfect target in the developing of contraceptive drugs for its specific location and capability in the process of semen liquefaction and capacitation of sperm as a receptor of seminal plasma protein semenogelin (SEMG1). It was reported that male monkeys immunized with the recombinant human Eppin could induce reversibly infertile. Our work found that two decapeptids at the C-terminal of Eppin were critical B cell epitopes, which overlapped with the binding site of Eppin and SEMG1, and its specific antibody could combine with the recombinant Eppin, inhibit the motility of human sperm and decrease the fertility in mice and rhesus. In order to increase the antifertility effect, we expect to set up the three-dimensional structure of Eppin to reveal the precise binding sites with SEMG1 to acquire a bunch of small molecule compounds by the computer simulation and molecule docking based on the soluble re-Eppin. According to the comparison among compounds by ProtenOn XPR36 in vitro and anti-fertility test in vivo, potential contraceptive drugs would be screened and selected for the intension of binding with SEMG1, effect of antimotility and antifertility. This project would establish a good foundation for the development of human contraceptive drugs.

人附睾蛋白酶抑制蛋白（Eppin）是非常理想的避孕制剂靶标。它特异性分布在附睾与精子表面，远离血睾屏障，不干扰生精过程；与SEMG1和PSA一起共同参与精液液化与精子获能；重组Eppin蛋白可使灵长类动物产生可逆性不育。项目组前期研究发现其C端两段十肽序列是Eppin的关键B细胞表位（重叠于Eppin-SEMG1结合位点处），其激发的特异性抗体可与Eppin合成肽及重组蛋白结合，从而干扰精子运动，导致小鼠及恒河猴生育力显著下降。为进一步提升抗生育效能，本课题拟在已获得全长Eppin可溶性蛋白基础上，依托其三维空间结构，深入解析Eppin-SEMG1蛋白结合位点，进而运用ProtenOn XPR36蛋白相互作用阵列系统和抗生育实验从体内、外多环节对比筛选小分子化合物，以期获得可与SEMG1定向、稳定结合，且能持续抑制精子运动的新型避孕分子，为研发人源避孕疫苗奠定基础。

人附睾蛋白酶抑制蛋白（Eppin）特异性分布在附睾与精子表面，远离血睾屏障，不干扰生精过程，非常理想的避孕制剂靶标。课题组前期研究发现其C端两段十肽序列是Eppin的关键B细胞表位（重叠于Eppin-Semg1结合位点处），其激发的特异性抗体可与Eppin合成肽及重组蛋白结合，从而干扰精子运动，导致小鼠及恒河猴生育力显著下降。本课题将定向干扰Eppin-Semg1结合位点作为核心，期望以蛋白质晶体结构的解析来推动避孕疫苗的改造。主要完成了：①可溶性Eppin蛋白的表达与纯化。2016-2017年约2年的时间里，课题组在原核和真核细胞表达体系中，前后在11种质粒、6种工程菌上、对全长及C端（75-129aa）的Eppin蛋白进行表达与纯化，最终获得了可溶性Eppin全长蛋白（MBP-Eppin）。②获得的可溶性全长MBP-Eppin蛋白稳定性差，易形成二聚体和多聚体。课题组选择液相层析法、离子交换等，成功地在较短的时间纯化，并用于Eppin-Semg-Psa复合体的研究，但在蛋白质晶体试验方面解析提示为标签蛋白。考虑到Eppin富含半胱氨酸，二级结构中含有七个二硫键，解析难度过大，短期内很难改变现有结果。课题组在分子模拟方面加大了尝试。③在Eppin氨基酸序列同源建模基础上，运用分子动力学分析，运算30ns（纳秒=1e-9秒）内的Eppin结构稳定性，从而获得了Eppin-Semg1的结合空间；经大规模运算筛选了1千4百万的小分子化合物，最终获得了可能干扰Eppin-Semg1的结合空间的小分子化合物9个。④9个化合物均可干扰Eppin-Semg1的结合点，通过结构动力学试验发现化合物4号和6号的理论综合测评优于其他7个，且二种化合物可延长人精液液化的时间（p<0.05），但对前向精子运动的比例无明显影响（p≥0.05）。深入研究这两种化合物在体外受精过程中的有效性与安全性将为小分子化合物的未来研发提供更加清晰的线索。