鼓泡式无溶剂反应体系酶催化甘油解反应机理及产物控制规律研究

以天然油脂为基料的功能性油脂和高效安全食品添加剂的设计与生物制造技术已经成为国内外研究热点，油脂甘油解反应是酶法催化制造这些产品的关键步骤。本项目采用鼓泡式无溶剂反应体系进行甘油解，研究其反应机理及产物控制规律。可望探明甘油解反应的反应类型、动力学和热力学特征，研究鼓泡式反应体系的传质和传热特性，掌握反应产物含量和酰基化转移的规律，明确不同脂肪酶催化的酰基区域选择性及酶学特征，为控制性甘油解反应奠定理论基础。. 本项目采用无溶剂鼓泡式体系甘油解以及用磷脂酶A1作为催化剂具有明显的原创性。无溶剂体系甘油解反应体系为典型的非均相界面反应体系，本项目研究获得的基础研究成果将丰富酶催化非均相界面反应理论体系，为酶法催化制造功能性油脂和甘油酯型食品添加剂产品的开发提供理论基础。

非均相酶法催化体系在食品、制药、化工等领域加工高附加值产品、功能食品以及绿色合成方面日益受到人们重视。本项目以非均相酶法催化的酯化及甘油解反应体系为研究对象，系统的研究了和比较了鼓泡式反应器体系以及传统的搅拌式反应体系，脂肪酶和磷脂酶催化反应的界面反应机理及产物控制规律。在磷脂酶Lecitase® Ultra催化酯化、磷脂酶Lecitase® Ultra的固定化、固定化酶在两种体系下催化甘油解及酯化以及产物分离纯化和应用方面做了详细研究。主要结果为：研究了游离磷脂酶Lecitase® Ultra催化油酸和甘油直接酯化法合成1,3-DAG （Diacylglyerol, 甘油二酯），考察有机溶剂和无溶剂体系的反应效果，对无溶剂体系中的合成工艺进行优化。发现该酶可实现DAG的快速酯化法合成，仅1.5 h反应，油酸酯化率达80.3%，产物1,3-DAG含量为54.8 wt%。研究了磷脂酶Lecitase® Ultra的吸附法固定化条件，发现大孔树脂DA-201为最佳载体，得到固定化磷脂酶Lecitase® Ultra（IM-LU）酶活为1652.4 U/g。吸附动力学研究表明Langmuir方程可较好地描述该吸附过程，为单层吸附。经固定化后，磷脂酶的Km增大，Vmax减小，酶的热、pH、金属离子和储藏稳定性都有所提高。FTIR测定结果显示，固定化过程中改变了酶分子的二级结构，其α-螺旋含量降低，β-折叠增多。研究了无溶剂体系IM-LU催化大豆油甘油解制备DAG的反应效果，对底物摩尔比、温度、加酶量等反应条件进行优化，经12 h反应，产物DAG含量为53.7 wt%。磷脂酶催化大豆油甘油解反应具有1,3-位点选择性，固定化过程未改变这一特性。与原料大豆油相比，DAG中饱和脂肪酸得到富集，亚油酸含量显著降低，油酸含量有一定升高。试制了新型鼓泡式反应器（BCR），将其用于IM-LU催化酯化合成1,3-DAG。与搅拌式反应器相比，BCR可节约酶制剂用量并加快反应进程，得到了快速合成1,3-DAG的工艺条件，经45 min反应，酯化率达86.4%，产物1,3-DAG含量为58.3 wt%。BCR可避免因机械搅拌导致固定化酶的快速剪切失活，提高酶的操作稳定性。采用Novozym 435催化时，酶重复使用30次时，酶活力仍然保持在94.5%，酶的重复利用次数大为提高。