基于蛋白相互作用的CD14多肽类抑制剂的设计及其对脓毒血症的药理作用研究

Sepsis is a SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) that induced by infection and endotoxin. Endotoxin (LPS) activates acute inflammatory response through the LBP-CD14-TLR4/MD2 signal pathway. Compared with TLR4/MD2 complex, the anti-inflammatory drugs based on CD14 inhibitors are barely investigated, although the body sensitivity against LPS could be reduced by CD14 gene knockout. Our group has been carrying out the medicinal chemistry and pharmacological research of anti-inflammatory drugs on TLR4 signal pathway for a long term. In the preliminary study, CD14 inhibitory peptides were designed through the analysis of LBP and CD14 transient PPI (Protein-Protein Interaction) and it turned out that the peptides could directly bind to CD14 and inhibit the LPS induced inflammatory cytokine release. Thus, we assumed that taking these inhibitory peptides (YK-12, GI-16, and LN-22) as lead compounds and understanding the CD14 binding mechanism could help us to design and discover new drug candidates for sepsis therapy and to enhance our understanding of the therapeutic target CD14. In this project, we plan to further clarify the binding mechanism between this kind of inhibitor and CD14 through a series of molecule-level research, to design and synthesize a series of derivative peptides through molecular docking and co-crystallization analysis, and to test their anti-inflammatory activities and have pharmacological research. We hope the project will provide a new drug target and new drug leading structures for sepsis therapy.

脓毒血症是一种由感染、内毒素引起的全身性炎症反应综合征。内毒素LPS通过LBP-CD14-TLR4/MD2的传递激活急性炎症反应。虽然CD14基因敲除可以降低机体对LPS敏感性，但相对TLR4/MD2复合物，CD14抑制剂抗炎药物研究鲜有报道。我们长期从事TLR4通路的抗炎药物化学和药理研究，前期工作通过对LBP与CD14瞬态蛋白相互作用分析，设计得到的多肽类抑制剂，可直接结合CD14并显著抑制LPS诱导的炎症因子释放。我们假设：以此类多肽抑制剂GI-16、YK-12和LN-22为先导，了解其与CD14的结合机制，有望设计和发现新的治疗脓毒血症的候选新药，增强对CD14靶点的认识。本项目拟通过系列分子层面研究，深入阐明此类抑制剂与CD14的结合机制；以其为先导基于分子对接、共晶结构，设计合成一系列衍生肽并进行抗炎测试和体内外药理研究。项目将为脓毒血症治疗提供新的靶点和药物结构先导。

脓毒血症是由感染引起宿主免疫反应失衡并最终发展成为威胁生命的器官功能障碍，而源头控制，适当和及时的抗生素给药是目前治疗脓毒血症的主要措施。LPS作为感染的早期传感器会与TLR4和MD2复合物结合进而激活先天免疫反应，而不受控制的LPS“瀑布反应”是导致机体诱发脓毒血症的原因。研究发现某些抗微生物肽可以和LPS结合起到中和LPS的作用，而且一些抗菌肽正进行临床研究或开发抗炎药物上市。由于同时具有广谱抗菌活性，中和LPS和调节免疫功能的能力，具有LPS中和能力的抗菌肽可以应用于抗炎或治疗脓毒症药物的开发。.在本研究中，通过相关算法我们以天然多肽MS-PT为模板设计合成了一系列衍生肽，经过筛选发现在MS-PT的第十位用赖氨酸替代苏氨酸可以显著降低其在水环境中的聚集倾向，得到衍生肽MS-PT1。接下来进行了一系列体外实验，验证了MS-PT1的体外抗炎活性。为了进一步探究它们体内抗炎抗脓毒血症的作用，我们建立了LPS诱导的脓毒血症小鼠模型用于研究它们的体内抗脓毒血症活性。在LPS诱导的小鼠感染性体克模型中，未接受抗菌肽治疗的小鼠在48小时内全部死亡。然而经过抗菌肽治疗后的小鼠存活率都有极大提高，10mg/kg的MS-PT1治疗组的小鼠存活率为100%。MS-PT1能够保护LPS所致的脓毒血症小鼠且在很大程度上提高小鼠的存活率。进一步我们在体外分子层面上确证了MS-PT1与LPS的结合能力，MS-PT1可以将LPS胶束解聚，并和LPS单体发生结合，且具有LPS内毒素中和能力，在水溶液中呈无规则卷曲二级结构但是会被LPS诱导成为α螺旋。而在胞内环境MS-PT1可能通过和膜上蛋白TLR4和MD2竞争性的结合LPS从而阻断掉LPS与TLR4和MD2结合，同时通过抑制LPS诱导NF-κB信号通路的活化从而起到缓解炎症的作用。最后我们合成丙氨酸筛选肽库，进行抗炎活性筛选，进一步指导构效关系研究。.本项目的研究确证了LPS中和肽作为治疗脓毒血症的先导分子的可行性。同时为治疗脓毒血症的药物设计和开发提供了理论依据和实验基础。.