基于血管内皮损伤的胞外组蛋白对脓毒血症进展的分子机制研究

Activation and dysfunction of endothelial cells (EC) play pivotal roles in sepsis progression . Recent studies have shown that extracellular histones are major mediators of death in sepsis, but the underlying mechanism is unknown. Treatment of the mice with activated protein C (APC) could significantly decrease the mortality. Our previous study showed that when compared with the control group，the levels of peripheral histones in children with multiple organ dysfunction syndrome (MODS) were significantly higher, and positively correlated with disease severity. Co-incubation of recombinant histone proteins with EC could induce production of cytokines and EC apoptosis, suggesting that extracellular histones might be a key factor in the pathogenesis of MODS. Therefore, we hypothesize that extracellular histones might activate EC by interacting with Toll-like receptors, leading to activation of NF-κB pathway, which cause production of a large number of inflammatory cytokines, and consequently EC apoptosis; at the same time reduce thrombomodulin expression and APC concentration which interferes with the extracellular histones metabolism, Such accumulation of extracellular histones might further exacerbate the inflammatory response-induced incidence of MODS. In order to demonstrate our hypothesis, we will first explore roles of extracellular histones on EC and its molecular mechanism in vitro; and we will then investigate the correlation between the concentration of extracellular histones/APC and sepsis severity. Completion of this project will not only supplement the molecular mechanism of MODS, but may also provide theoretical support for extracellular histones serving as a potential biomarker for the progression of sepsis.

血管内皮细胞(EC)活化和功能障碍是脓毒症发展恶化的中心环节。最近研究表明胞外组蛋白是脓毒症关键致死因素，其机制不明，但利用活化蛋白C（APC）酶切组蛋白可显著降低脓毒症小鼠死亡率。我们前期工作发现脓毒症伴多脏器功能障碍综合征(MODS)患儿血清中组蛋白浓度明显增高，且与疾病严重程度正相关；此外，重组组蛋白与EC共同孵育，可引起炎症因子释放并诱导EC凋亡。我们推测，组蛋白可能通过激活EC上Toll样受体激活NF-κB信号通路，引起大量炎性因子释放并诱导EC凋亡；同时下调血栓调节素表达、降低APC含量进而干扰组蛋白的正常代谢、致使大量组蛋白累积促发MODS发生。为验证本推断，我们将首先探索组蛋白对EC的作用及其机制；然后阐明组蛋白/APC表达水平差异与脓毒症严重程度的相关性。本研究的完成将丰富脓毒症及MODS致病的分子机制，也为组蛋白作为脓毒症疾病进展的分子生物学标记物的可能性提供理论依据。

背景：脓毒症是当前重症监护病房所面临的棘手难题，由于目前缺乏合适的组蛋白标准品，至今无法对患者体内的胞外组蛋白进行精确定量。目前仍少有研究关注脓毒症患者疾病严重程度和循环组蛋白浓度之间的关系。方向：本研究将探讨脓毒症患儿循环组蛋白水平与患儿疾病严重程度和预后之间的关系，并探究组蛋白对内皮细胞损伤的作用机制和将肝素作为干预手段的可能性，以期改善脓毒症患儿的预后。主要研究内容：1）培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,用小牛胸腺组蛋白（CTH）以不同蛋白浓度和不同处理时间共孵育后，流式细胞仪检测细胞存活率，电镜比较其形态学的变化。Western检测NF-κB及MAPK信号通路蛋白IκB以及磷酸化p38/p38表达水平；ELISA法检测TNF-α、IL-6表达水平。2）建立脓毒症动物模型，检测其胞外组蛋白水平。在体外细胞实验和小鼠CLP模型中，利用肝素拮抗组蛋白，研究其保护机制。3）选取健康对照、脓毒症及严重脓毒症儿童，测定其胞外组蛋白浓度，并分析其与疾病的相关性。4）用大肠杆菌表达单体变性组蛋白H3和H4，并分离纯化组蛋白单体。重要结果及关键数据：1）CTH处理后，HUVEC的生存率呈剂量和时间依赖性下降。组蛋白可以激活NF-κB及MAPK通路，并释放TNF-α、IL-6等炎性因子。应用肝素处理后HUVEC细胞的存活率明显上升（P<0.001）。扫描电镜和投射电镜观察CTH处理后HUVEC发现细胞膜破坏现象。2）在CLP模型中应用肝素可明显延长实验动物的生存时间。3）严重脓毒症患儿血清中组蛋白浓度显著增高（19.17 ± 10.20），且与脓毒症的严重程度相关。4）用大肠杆菌表达单体变性组蛋白 H3 和 H4，亲和纯化后用梯度稀释和透析方法，可以得到复性的组蛋白单体。科学意义：在脓毒症患者中细胞外组蛋白增高是其重症的预警指标，其浓度与疾病严重程度及病死率成正相关。组蛋白以时间和剂量依赖方式通过激活NFκB及MAPK信号通路诱导HUVEC细胞损伤。胞外组蛋白在脓毒症中通过对血管内皮细胞的毒性作用，介导疾病进程，而这一毒性作用与破坏内皮细胞细胞膜有关，肝素可以通过中和组蛋白拮抗其毒性，且拮抗作用不依赖其抗凝活性。重组组蛋白 H3/H4 复合物可以作为精确定量组蛋白的标准品，对基于组蛋白含量的疾病分级和组蛋白毒性机制的研究均有应用价值。