猪流行性腹泻病毒(PEDV) 侵染过程中第三阅读框( ORF3)编码蛋白的作用机制研究

The genome of porcine epidemic diarrhea virus is a single stranded and positive-sense RNA, among which the function unknown ORF3 locates between the spike and envelop gene. It is believed that PEDV ORF3 has influence on the viral virulence. However, direct evidence to prove this inference is still in need. In our earlier study we found the PEDV without ORF3 gene could not effectively infect its animal host. In this project, we will investigate whether PEDV ORF3 bind independently to the surface glycoproteins of porcine intestinal mucus membrane or cooperate with other viral membrane proteins to bind to the surface glycoproteins to counteract protection effect of mucus layer of intestinal mucus membrane and facilitate the infection process. The newly established PEDV reverse genetic system by the applicants and the Netherlands scientists will be employed to rescue recombinant viruses to study the interaction of PEDV ORF3 and surface glycoproteins of porcine intestinal mucus membrane. Advanced molecular biology platforms such as yeast two-hybrid system and cDNA library will also be employed to explore the interaction between ORF3 protein and glycoprotein or ORF3 protein with viral membrane structural proteins. The results obtained from this project will facilitate the elucidation of the mechanisms through which ORF3 protein influence PEDV pathogenicity and provide theory basis for PEDV vaccine design and clinical control strategies.

猪流行性腹泻病毒的基因组为单股正链RNA。在其纤突蛋白基因S和小膜蛋白基因E之间是未知功能的第三阅读框（ORF3）。目前普遍认为ORF3蛋白影响PEDV毒力，但尚未得到实验证实。我们前期研究显示，ORF3蛋白可能在PEDV的体内侵染中发挥关键作用。本课题将研究PEDV ORF3如何与猪小肠粘膜表面糖蛋白直接结合，或协同PEDV其他囊膜蛋白与猪小肠上皮粘膜表面糖蛋白结合，从而发挥促进PEDV侵染宿主细胞的作用。研究中将采用项目组最新建立的PEDV反向遗传操作系统拯救重组病毒研究ORF3蛋白与肠上皮细胞糖蛋白的相互作用。研究也将利用cDNA文库构建、酵母双杂交等先进分子生物学技术研究ORF3蛋白与PEDV宿主糖蛋白以及PEDV囊膜结构蛋白的相互作用关系。研究成果将有助于阐明ORF3基因及编码蛋白影响PEDV毒力的相关机制，并将为PEDV新型疫苗研制及临床防控提供理论依据。

PEDV拥有唯一的附属基因ORF3，编码224个氨基酸的膜蛋白，有离子通道活性并促进病毒产生。但对其细胞内转运及在病毒感染过程中的功能研究还很少。本研究中我们先考察了敲除该基因编码蛋白对病毒增殖的影响。为此我们通过定点RNA重组技术获得了四个不同的重组PEDV病毒，其中3个携带全长ORF3（来自CV777,DR13以及地方流行NY毒株）,另一个重组病毒的ORF3则完全删除，研究中也包括了传代致弱的DR13 PEDV毒株（其ORF3编码蛋白只保留了N端91个氨基酸）。实验结果显示携带ORF3的病毒（包括弱毒株DR13）其增殖能力明显高于完全删除ORF3的病毒。进一步分析发现是否携带ORF3对PEDV诱导的细胞凋亡有显著影响：携带ORF3的病毒（包括弱毒株DR13）其诱导的细胞凋亡程度低于不携带ORF3的病毒。结合上述发现我们得出了PEDV ORF3可以通过抑制感染细胞凋亡促进自身增殖的结论。另外，利用这些重组病毒和细胞传代弱毒株DR13，加之构建的ORF3真核细胞表达载体，我们发现了全长ORF3合成后在高尔基体(Golgi apparatus)积累，有部分ORF3蛋白转运到了细胞膜。但弱毒株的C-端截短ORF3由于缺乏高尔基体转运信号，滞留于内质网(ER)以及内质网-高尔基中间体（ERGIC）。最后我们判断ORF3蛋白可以利用外分泌通路在细胞内转运聚集于高尔基体并同时发挥功能。这些发现为ORF3蛋白在PEDV的致病性中的作用机制的提供了重要线索。