猪流行性腹泻病毒(PEDV)蛋白酶与复制酶复合体形成机制研究

蛋白酶是冠状病毒复制周期中的一种重要调节蛋白，其对冠状病毒多聚蛋白1a（1ab）加工产物和宿主细胞成分参与形成病毒复制酶复合体（RC），但是RC形成及其活性调节机制还不清楚。我们前期研究发现，冠状病毒蛋白酶对冠状病毒多聚蛋白1a（1ab）加工产物定位于细胞核周内质网（ER）膜上，提示细胞内膜系统在RC形成过程中具有重要作用。本项目以猪流行性腹泻病毒(PEDV)为研究对象，利用蛋白酶测定技术、反向遗传学技术和基于病毒的串联亲和纯化-质谱 (TAP-MS) 技术，研究：(1) PEDV PLP蛋白酶功能；(2) PEDV蛋白酶对多聚蛋白1a(1ab)加工产物参与RC形成及其动态调节机制；(3) 发现并鉴定参与冠状病毒RC形成的宿主蛋白，阐明宿主蛋白参与RC形成及其调节机制。项目对揭示蛋白酶和细胞内膜系统参与复制酶复合体形成的选择性调节机制，阐明冠状病毒病毒复制与转录分子机理具有重要理论意义。

木瓜样蛋白酶是冠状病毒的主要蛋白酶之一，是冠状病毒复制酶复合体形成和病毒RNA复制和转录过程中具有重要调节作用的蛋白。猪流行性腹泻病毒有两个木瓜样蛋白酶（PLP1和PLP2）。我们的研究表明：PLP1无去泛素化酶（DUB）活性，对IFN也无拮抗作用；而PLP2具有明显地DUB活性， PLP2 DUB活性对K48和K63连接的多聚泛素化无底物特异性。PLP2的 3个蛋白酶催化活性位点突变体DUB活性明显被抑制，说明PLP2蛋白酶催化活性位点同时也是其DUB活性关键位点。PLP2是PEDV编码的一种干扰素拮抗蛋白，其干扰素拮抗活性与蛋白酶活性密切相关。PLP2能够抑制宿主抗病毒天然免疫系中重要模式识别受体RIG-I激活的IFN-β、NF-κB和IRF3通路和STING激活的IFN-β和IRF3通路；通过对RIG-I和STING的去泛素化负调节宿主抗病毒天然免疫反应。PEDV弱毒株全基因组序列由27953个核苷酸组成，与CV777的序列同源性为97.6%。PEDV弱毒株5’非编码区由292 nt组成，比CV777的少4 nt；在复制酶基因、S基因和ORF3分别缺失24 nt、3 nt和49 nt。构建了含巨细胞病毒早期启动子序列、PEDV 5’端序列（402bp）、多克隆位点序列、PEDV 3’端序列（2434bp，含多聚腺苷化尾巴）、丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列、牛生长激素（BGH）终止和多聚腺苷化序列 6个元件的中间质粒pBAC-PEDV-5’-3’。通过融合PCR得到构建全长cDNA克隆的4个片段（AB、C、D、E）。将4个片段依次连接到中间质粒pBAC-PEDV-5’-3’，得到含全长cDNA克隆的重组质粒pBAC-PEDV-FULL。用该重组质粒转染Vero E6细胞拯救重组病毒，重组病毒能够引起Vero E6细胞发生病变，套式RT-PCR能够检测到重组病毒F2代的正链和负链RNA；电镜能够检测到重组病毒F5代的病毒粒子，F5代的5’端序列与重组质粒pBAC-PEDV-FULL、亲本毒株的同源性分别为99.9%、99.6%；利用引入的分子标签能够对重组病毒和亲本毒株进行鉴别诊断。受项目资助：发表SCI文章3篇，中文核心期刊文章1篇；培养研究生5名。