猪流行性腹泻病毒（PEDV）适应Vero细胞的关键分子基础研究

It is usually very difficult to replicate field PEDVs on cultured cells, which blocked vaccine development severely for fighting the newly emerging epidemic of PED. The successfully cell-cultured PEDV strains were all adapted on Vero cells, whereas the molecular determinant of cell adaptation remains unknown. Spike (S) protein is the key viral structure in coronovirus cell adaptation and tropism. Thus in this study we will focus our research on the S protein and construct a series of recombinant PEDV strains carrying chimeric S protein genes, which are S genes of VERO cell adapted DR13 strains partly substituted by that of the non cell adapted DR13 strain. For rescuing the recombinant PEDVs, the RNA targeted recombination system, which was newly developed by our lab and Utrecht University will be employed. Immunofluorescent staining (IFA), plaque purification and virus growth curves determination will be carried out on the recombinant viruses to examine the effect of S gene fragment substitution and point mutation on their phenotype variation of cell adaptation. This study aims to identify the key motifs or sites determining PEDV Vero cell adaptation, which, in the near future, can make it possible to transform PEDV to VERO cell adaptation by genome manipulation.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）的细胞培养难题是应对PEDV新疫情挑战的最大障碍之一。目前有限的几株能细胞培养的毒株均适应于Vero细胞，但对其适应细胞的分子基础还不清楚。冠状病毒表面纤突（S）蛋白在病毒细胞适应和嗜性方面发挥重要作用，因此本研究锁定S蛋白作为研究对象，利用项目组最新与荷方建立的首个基于RNA Targeted Recombination技术的PEDV反向遗传学操作平台，用DR13非细胞适应株S基因逐段替换其Vero细胞适应株的对应片段，构建一系列携带嵌合S基因的重组PEDV病毒。采用细胞免疫荧光抗体染色（IFA）法、噬斑纯化、病毒生长曲线测定等方法观察S基因片段替换、位点突变对PEDV细胞适应性的影响。旨在阐明S基因决定PEDV细胞适应的关键位点或基序，为PEDV细胞适应改造提供直接操作靶点，为解决PEDV细胞培养难题提供新的理论和技术方法。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起猪（特别是新生仔猪）急性、高度传染性消化道疾病的主要病原之一。2010年以来，PED的再次爆发给我国乃至全球养猪业造成了巨大经济损失。猪流行性腹泻病毒（PEDV）的细胞培养难题是及时应对PEDV新疫情挑战的最大障碍之一。猪流行性腹泻病毒（PEDV）适应Vero细胞的关键分子基础揭示对快速获得临床流行毒株、研究其特性、开发针对流行毒株的新一代疫苗及时应对PEDV的新疫情具有重要意义。鉴于冠状病毒纤突（S）蛋白在病毒细胞适应和嗜性方面发挥重要作用，本项目组利用与荷方建立的基于RNA定点重组的PEDV反向遗传学操作平台，以PEDV DR13非细胞适应的亲本株S基因分段替换其Vero细胞适应疫苗株的对应片段，构建了一些列携带嵌合S基因的重组PEDV。成功拯救到不依赖于胰酶的重组PEDV毒株15株。将PEDV DR13亲本毒株的胰酶依赖特性关联到其S蛋白的四个氨基酸残基，即分别是S蛋白的605、633、635以及891位氨基酸残基。同时，本项目通过优化PEDV反向遗传学操作系统各项技术参数，如mRNA的使用量、胰酶的种类及添加浓度、电击时间及次数等，提高了利用操作系统的获得重组病毒效率。本研究建立的提高胰酶依赖型PEDV Vero细胞培养病毒滴度的新方法，可以将胰酶依赖型PEDV的滴度提高20倍左右。本研究的实施为PEDV的细胞适应改造工作提供直接的操作靶点，为彻底解决PEDV的细胞培养难题提供了有效候选措施。本项目的实施也为PEDV细胞侵染特性及其S蛋白结构和功能的解析奠定了重要的前期基础。