猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白介导细胞侵染的分子机制

PEDV has received an increasing attention as the important pathogen causing diarrhea in piglets. Studies has confirmed the genomic mutation in recent strains. However, less is know about the pathogenesis of PEDV. Intracellular infection of virus is the key step for virulence. Exploration of the interaction between PEDV and host cells is necessary for understanding the pathogenesis of PEDV. The aim of this study is to investigate the receptor of S protein of PEDV for cell infection, and screen the other protein-protein interaction of PEDV proteins in Vero cells, by using BiFC, CO-IP and mass spectrum. It is expected to clarify the mechanism of S protein in intracellular infection, and to support the future studies of PEDV pathogenesis and medicine development against PEDV infection.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪腹泻是近年来严重危害我国养猪业的一种重要传染病，现已证实新流行的PEDV基因组发生明显变异，但目前对于PEDV感染致病的机理尚不明晰，病毒侵染细胞是病毒发挥其致病能力的关键环节，揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用是阐明PEDV感染致病机制的基础，本项目以PEDV新流行毒为实验材料，拟从解析纤突（S）蛋白在介导PEDV侵染细胞过程中的分子细节入手，利用BiFC系统、CO-IP、质谱分析等病毒分子生物学试验技术和方法，从病毒与感染细胞两个方面，探索PEDV的S蛋白与其受体蛋白互作的功能域及其作用途径，挖掘Vero细胞中与PEDV编码蛋白相互作用的未知受体蛋白，分析其对PEDV感染、复制与增殖能力的影响，探讨PEDV S蛋白在病毒侵染细胞过程中的生物学意义，为阐明PEDV感染和致病机理以及抗PEDV感染有效药物的研制提供理论依据。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪腹泻是近年来严重危害我国养猪业的一种重要传染病，现已证实新流行的PEDV基因组发生明显变异，但目前对于PEDV感染致病的机理尚不明晰。病毒侵染细胞是病毒发挥其致病能力的关键环节，揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用是阐明PEDV感染致病机制的基础。本项目在分离鉴定PEDV新流行毒株的基础上，开展了下列研究工作：（1）分析PEDV侵染Vero细胞特性，掌握了其增殖规律和特性。通过动物实验观察了临床症状和组织病理学特征，发现与经典毒株比较有了明显改变。（2）制备了多株针对PEDV S蛋白、N蛋白的单克隆抗体并鉴定了最小抗原表位。（3）确定了PEDV 流行毒株SHpd/2012的S蛋白与pAPN蛋白相互作用的功能域，并推测新流行毒株互作功能域两端的关键氨基酸（异亮氨酸）对于互作功能域的划分起主要作用。（4）利用pulldown结合蛋白质谱分析，获得PEDV侵染细胞互作蛋白268个，通过Gene Ontology、KEGG Pathway分析，用String数据库绘制蛋白互作网络图，初步确定了PEDV在感染Vero细胞时可能与S蛋白发生互作的蛋白质范围（共七个蛋白）。（5）建立了猪肾细胞cDNA文库，通过酵母双杂交技术筛选出4个宿主细胞蛋白LDHB、SERTAD3、GMS2和PSMB10与NSP8蛋白互作。通过免疫共沉淀试验和亚细胞定位观察确认了LDHB蛋白被NSP8沉淀，且两者产生共定位现象。综上所述，项目解析了S蛋白在介导PEDV侵染细胞过程中的分子细节，从病毒与感染细胞两个方面，探索了PEDV的S蛋白与其受体蛋白互作的功能域及其作用途径，挖掘了Vero细胞中与PEDV结构蛋白和非结构蛋白相互作用的未知受体候选蛋白，初步确定了PEDV S蛋白在病毒侵染细胞过程中的生物学意义，为阐明PEDV感染和致病机理以及抗PEDV感染有效药物的研制提供了理论依据。