家族性并指（趾）多指（趾）畸形致病基因鉴定和分子机理研究

Synpolydactyly (SPD), a common monogenic dominant disorder, has deleterious effects on the quality of life. In our previous study, we described a six-generation SPD family with 94 members and 22 affected members alive. Based on exome sequencing technology, 172 candidate causative genes bearing 140 single nucleotide variants and 32 insertion and deletion mutations were identified. To determine the causative mutation and related gene, we will screen these candidate mutations in other members of this family using PCR-Sanger sequencing method. By over expressing the mutated gene in developing chick limb and analyzing the resulting phenotype, we will further verify the pathogenicity of gene mutation. With green fluorescent protein fusion expression system and confocal laser scanning microscope technology, we will monitor the gene expression dynamics in limb development and reveal the effect of pathogenic mutation on gene expression and location. HOXD13 was demonstrated to be key regulator in limb development. Using in-situ hybridization technique to detect the difference in transcription of the causative gene between chick limbs over expressing wide type and mutated HOXD13, we will explore their regulatory relationship and then regulatory pathway. With related methods in informatics and biochemistry we will also study the effect of mutation on protein structure or function. This project will shed new light on understanding the molecular mechanism of SPD and provide scientific basis for diagnosis and prevention.

家族性多指（趾）并指（趾）畸形（SPD）是常见单基因显性遗传病，严重影响患者生活质量。本项目组收集到一个SPD大家系，共6代94人，现存患者22人。采用外显子组测序技术确定了172个候选致病基因，包含140个单核苷酸位点突变和32个插入缺失突变。本研究将采用PCR-Sanger测序技术，在家系其他成员中对候选突变进一步验证，确定致病突变及相关基因；建立该突变基因鸡胚过表达模型，分析肢体发育表型，确定基因致病性；通过绿色荧光蛋白融合表达和激光共聚焦显微镜技术，研究基因在鸡胚发育过程中表达特征，确定突变对于其表达和定位的影响；在过表达野生型和突变型HOXD13鸡胚中，采用原位杂交方法检测致病基因转录水平，探讨二者调控关系及致病基因调控通路；采用生物信息学和生物化学相关方法，研究该突变对于蛋白质结构和功能的影响。本项目研究结果将有助于进一步阐明SPD发生机制，为疾病诊断和预防提供科学依据。

家族性并指（趾）多指（趾）畸形是一类罕见的常染色体显性遗传病，主要表现为手部3/4指并指和（或）足部4/5趾并趾，并发不同程度的多指（趾），目前，仅发现两个基因的突变和该疾病发生有关，而一些疾病家系的致病原因仍然未知。本项目收集到一个患有并指（趾）多指（趾）畸形的中国大家系，该家系可追溯6代共94人，其中27人患有畸形。我们选择家系中的6人进行了全外显子组测序，通过家系分析鉴定到一个TTC30B c.C1124T基因突变，该基因突变导致编码蛋白Ala375Val突变，进一步对其他家系成员的PCR-Sanger测序验证及家系连锁分析确定，该突变和家系疾病表型表现为共分离，且最大LOD值为3.918，最终证明该突变为致病突变。因此，TTC30B为第三个与并指（趾）多指（趾）畸形发生有关的重要基因；通过采用CRISPR/Cas9技术，我们构建了Ttc30b-/-基因敲除小鼠模型，发现该基因缺失导致小鼠尾骨发育异常，显示Ttc30b对胚胎远端器官的发育调控具有重要作用。在人类视网膜上皮细胞系中，采用RNAi技术，敲低该基因影响Shh信号通路的激活；采用同源建模方法，我们搭建了TTC30B蛋白质的高级结构模型，发现Ala375位于TTC30B蛋白的结构最为保守的位置。预测结果进一步显示，Ala375Val突变将引起蛋白折叠自由能升高3.8 kcal·mol-1 ，说明该突变位点将严重影响蛋白的结构及稳定性。本研究项目发现了一个新的和并指（趾）多指（趾）畸形发生相关的重要基因，并初步揭示了该基因突变导致疾病发生的分子机理，该研究结果为该疾病的临床诊断、分类和产前诊断提供了坚实的科学依据，对进一步理解胚胎指（趾）发育调控的分子机理具有重要意义。